AB-8大孔樹脂分離純化人參保健酒皂苷的工藝研究

諸曉波，李德坤，郭巧生*，鞠愛春*，葉正良*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所，江蘇 南京 210095；2.天津市中藥注射劑安全性評(píng)價(jià)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300402；3.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 300402）

人參是五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根莖，具有抗疲勞、抗腫瘤、提高免疫力、補(bǔ)氣安神［1］等功能。人參主要含有人參皂苷 Rb1、Rg1等30多種人參皂苷，并含有人參多糖、人參揮發(fā)油等多種活性成分。人參具有良好功能，故被制作成各種保健品，然而人參保健酒藥材多、成分復(fù)雜，不利于質(zhì)量監(jiān)控。

人參保健酒的樣品前處理主要集中在皂苷的分離純化、大孔吸附樹脂［2-3］、萃取［4］等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中比較了幾種不同樣品前處理方法對(duì)含量測定的影響，最終篩選出AB-8大孔吸附樹脂純化分離人參單體皂苷，以人參皂苷Rg1、Re、Rb1為指標(biāo)，利用HPLC法測定含量，進(jìn)行工藝研究。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了人參皂苷的工藝參數(shù)，包括吸附量、吸附流速、洗脫溶酶濃度、洗脫流速等，為人參保健酒中皂苷含量測定提供參考。

1 儀器和試藥

Waters2695高效液相、Waters2489紫外檢測器、Empower2工作站 ［沃特世科技（上海）有限公司］；METTLER XS105型十萬分之一電子分析天平 ［梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司］；數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；色譜柱：艾杰爾Venusil MPC18（2）（序列號(hào)：VA952505-2，天津博納艾杰爾科技有限公司）；布琦水浴鍋（瑞士布琦有限公司）；層析柱；常規(guī)玻璃儀器等。

人參保健酒樣品（自制）；人參皂苷Rg1（中國食品藥品檢定研究院，純度91.7%，批號(hào)：110703-201530）；人參皂苷Re（天津一方科技有限公司，純度98%，批號(hào)：Am250G）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：93.7%，批號(hào)：110704-201424）；磷酸（分析純，天津華東試劑廠）；乙腈、甲醇為色譜純（美國OMNI公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；AB-8型大孔吸附樹脂（孔徑13～14 nm，天津市海光化工有限公司）。

2 保健酒中人參皂苷含量測定

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品適量，用甲醇定容至25 mL量瓶中，制成混合對(duì)照品溶液，搖勻，質(zhì)量濃度分別為Rg1：0.670 1 mg·mL-1，Re：0.692 7 mg·mL-1，Rb1：1.134 2 mg·mL-1，備用。

2.2 供試品溶液的制備

取15 mL保健酒樣品水浴揮干，用水溶解后上預(yù)先處理好的AB-8樹脂柱（60～80目，柱內(nèi)徑6～8 mm，樹脂柱高約10 cm），用0.05 mol·L-1的氫氧化鈉沖洗，棄去；30%甲醇溶液沖洗，棄去；甲醇洗脫至蒸發(fā)皿中，水浴揮干，用1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。

2.3 人參專屬性溶液制備

人參保健酒的處方中不加入人參藥材制成陰性對(duì)照，溶液制備方法同供試品溶液的制備項(xiàng)下方法。

2.4 色譜條件

色譜柱：艾杰爾 Venusil MP C18（2）分析柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；柱溫為30℃；檢測波長為203 nm；進(jìn)樣量為10μL。

2.5 含量測定

分別吸取對(duì)照品溶液、樣品溶液、人參專屬性樣品進(jìn)樣，計(jì)算含量，色譜圖見圖1。

表1 液相梯度洗脫程序

圖1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量測定HPLC圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取對(duì)照品母液1.0、3.0、5.0、6.0、8.0 mL，分別用甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，將峰面積Y與對(duì)照品濃度X作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：YRg1＝5×106X+28 819，r＝0.999 61；YRe＝4×106X+28 819，r＝0.999 29；YRb1＝3×106X+28 819，r＝0.999 67，人參皂苷Rg1在0.134 0～0.067 0mg·mL-1線性良好；人參皂苷Re在0.138 5～0.069 7mg·mL-1線性良好；人參皂苷Rb1在0.143 5～0.113 4mg·mL-1線性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述同一對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定色譜峰面積。人參皂苷Rg1、Re、Rb1的RSD分別為0.19%、0.12%、0.16%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0、4、8、12、16、20 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μL，人參皂苷Rg1、Re、Rb1的RSD分別為0.12%、0.05%、0.13%，表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1在20 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批人參酒樣品，按2.2項(xiàng)下制備6份供試品溶液，測定。人參皂苷Rg1、Re、Rb1的RSD分別為0.9%、1.0%、1.3%，表明樣品處理方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

吸取已知含量的樣品6份，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按各2.2項(xiàng)下制備樣品，測定，計(jì)算加樣回收率。人參皂苷Rg1、Re、Rb1的平均回收率為 97.43%、98.24%、97.58%，RSD分別為0.51%、0.47%、0.86%。

3 工藝條件及參數(shù)優(yōu)化

3.1 大孔樹脂預(yù)處理

AB-8型大孔樹脂是苯乙烯弱極性共聚體，本實(shí)驗(yàn)使用的是凈品樹脂，新樹脂使用前加入高出樹脂層2～3 cm乙醇浸泡3 h，用水沖洗至中性，備用。

3.2 泄漏曲線考察

取保健酒樣品40.0 mL水浴揮干，用等量水溶解后上裝有AB-8大孔樹脂2 g的層析柱（柱體積約3 mL），控制流速為0.6 mL·min-1，每5.0 mL為1個(gè)流份，收集8份，蒸干，照2.2項(xiàng)下自 “上預(yù)先處理好的AB-8樹脂柱”起，依法制得供試品溶液，并測定各流份中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量。以過柱液中3個(gè)皂苷含量為縱坐標(biāo)，累計(jì)上樣體積為橫坐標(biāo)，繪制泄漏曲線，見圖2。

圖2 人參皂苷泄漏曲線考察

結(jié)果顯示，從第5流份開始，流出液顏色逐漸加深，人參皂苷開始泄漏，故可確定最大上樣量為20 mL，即2 g AB-8樹脂可以吸附1 g生藥量。

3.3 洗脫溶媒濃度考察

3.3.1 甲醇濃度考察 吸取10.0 mL保健酒樣品，水浴揮干溶解后上已處理好的AB-8柱（柱體積約3 mL），依次用純化水、0.05 mol·L-1氫氧化鈉、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、純甲醇各20.0 mL進(jìn)行梯度洗脫，分別收集洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用 HPLC法測定人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量，以確定甲醇的濃度，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度甲醇洗脫皂苷含量

由表中可知，30%甲醇對(duì)皂苷洗脫無影響，90%甲醇洗脫率最高，累計(jì)洗脫率達(dá)95.41%，故確定90%的甲醇作為洗脫劑。

3.3.2 氫氧化鈉濃度考察 在3.3.1項(xiàng)的基礎(chǔ)上考察氫氧化鈉的濃度。吸取滲漉液3份各10.0mL，水浴揮干溶解后上預(yù)先處理好的 AB-8柱（柱體積約3 mL），依次用純化水、不同濃度的氫氧化鈉（收集）、30%甲醇、90%甲醇洗脫，收集洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。

由表3可知，隨著氫氧化鈉濃度增加，90%甲醇洗脫液中人參皂苷含量下降。當(dāng)氫氧化鈉濃度為0.15 moL·L-1時(shí)，含量最低，故選擇0.05 moL·L-1氫氧化鈉作為除色素溶液。

表3 不同氫氧化鈉濃度皂苷含量

3.4 洗脫溶媒用量考察

90%甲醇洗脫用量考察：吸取10.0 mL保健酒樣品，水浴揮干溶解后上預(yù)先處理好的AB-8柱（柱體積約3 mL），依次用純化水、0.05 moL·L-1氫氧化納、30%甲醇洗脫，棄去，90%甲醇洗脫，洗脫流速：0.6 mL·min-1，每5 mL收集1份洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，以確定90%甲醇洗脫用量，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫劑用量考察曲線圖

由下圖可知，當(dāng)洗脫劑用量為10 mL時(shí)，樹脂顏色變淡，洗脫劑用量為15 mL時(shí)，洗脫液顏色變白，當(dāng)90%甲醇洗脫劑用量為20 mL時(shí)，洗脫的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量為100%。故最佳洗脫體積為20 mL。

3.5 洗脫流速考察

吸取滲漉液4份各10.0mL，水浴揮干溶解后上已處理好的AB-8柱（約3 cm高），依次用純化水、0.05 moL·L-1氫氧化鈉、30%甲醇洗脫，棄去，用20 mL 90%甲醇洗脫，洗脫流速分別調(diào)至0.3、0.6、1、1.5 mL·min-1，收集洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，以確定洗脫流速，結(jié)果見表4。

表4 人參皂苷洗脫流速考察結(jié)果

由上表可知當(dāng)洗脫速度為0.3 mL·min-1時(shí)，洗脫下來的皂苷含量最高，但0.6 mL·min-1洗脫速度的洗脫率較高，從時(shí)間上考慮，選擇0.6 mL·min-1的洗脫速度。

3.6 樣品前處理AB-8大孔樹脂純化富集工藝驗(yàn)證

選用AB-8大孔吸附樹脂，條件為上樣量10.0mL（0.5 g生藥量／g樹脂），0.05 moL·L-1氫氧化鈉、30%甲醇洗脫，棄去，20 mL 90%甲醇洗脫，洗脫流速為0.6 mL·min-1。收集洗脫液于蒸發(fā)皿水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。

表5 重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果（n＝4）mg

結(jié)果顯示，在該工藝條件下，人參皂苷測得量較高，色譜圖較好，提示該工藝可行，可用于保健酒質(zhì)量控制中HPLC測人參皂苷Rg1、Re、Rb1。

4 討論

本文選用AB-8大孔吸附樹脂富集純化人參皂苷，通過考察人參皂苷泄露曲線、甲醇洗脫濃度及用量、氫氧化鈉洗脫濃度、甲醇洗脫速度為人參保健酒皂苷檢測提供參考。本文研究發(fā)現(xiàn)，單體皂苷和人參總皂苷的檢測不同，洗脫劑的濃度也不同，許多文獻(xiàn)表明，70%或80%的乙醇［5］對(duì)總皂苷的洗脫率最高，而本研究表明，人參單體皂苷適宜的洗脫濃度為90%甲醇。氫氧化鈉作為除色素常用的堿時(shí)，要注意考察濃度，濃度過高，人參皂苷含量反而下降。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］ 王博.人參酒中人參皂苷前處理技術(shù)研究［J］.人參研究，2016，28（6）：18-19.

［3］ 郭婷婷，王兆華，張大軍.大孔樹脂分離純化西洋參葉總皂苷的工藝研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2016，18（9）：1196-1200.

［4］ 姚海燕，萬玉華，沈雅婕，等.大孔吸附樹脂純化人參總皂苷的工藝研究［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6（2）：84-88.

［5］ 黃立新，熊友文，張啟云，等.紅參中人參總皂苷的大孔樹脂純化工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（6）：6-9.