苦杏仁中苦杏仁苷的閃式提取工藝研究

禹琦

（湖南婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000）

苦杏仁為薔薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亞杏 Prunus sibirica L.、東北杏 Prunus mandshurica（Maxim.）Koehne或杏Prunus armeniaca L.的夏季采收的干燥種子。具有降氣止咳平喘、潤(rùn)腸通便之功能。常用于咳嗽氣喘、胸滿痰多、腸燥便秘［1］。其主要有效成分是苦杏仁苷，也稱維生素 B17，具有止咳［2］、平喘［3］之功能，此外，其對(duì)心血管［4］、消化系統(tǒng)［5-6］、免疫系統(tǒng)［7-8］、泌尿系統(tǒng)等［9］也具有藥理作用。

目前關(guān)于苦杏仁苷的提取報(bào)道較多，主要是煎煮、回流、超聲等傳統(tǒng)方法，都存在提取時(shí)間較長(zhǎng)、溶劑消耗大、能耗大等問題。苦杏仁苷是一種氰苷類物質(zhì)，分為D型和L型，前者有藥理活性后者卻沒有。而D型苦杏仁苷在高溫下會(huì)轉(zhuǎn)變成L型從而失去藥理活性［10］。所以常規(guī)提取方式有可能會(huì)引起D型苦杏仁苷的異構(gòu)化，而導(dǎo)致失活。閃式提取技術(shù)是一種新型提取方法，它是利用閃式提取器將浸泡在溶劑里的物質(zhì)快速破碎，并通過超強(qiáng)振動(dòng)與高速攪拌讓有效成分迅速釋放出來的一種提取方法［11］。閃式提取時(shí)間短至幾分鐘甚至幾秒鐘，溶劑用量小，能耗低，且無(wú)須加熱，有利于對(duì)熱不穩(wěn)定物質(zhì)的提取［12-13］。目前還未見到有關(guān)苦杏仁苷閃式提取法的報(bào)道。筆者通過實(shí)驗(yàn)研究閃式提取法提取苦杏仁苷，希望為苦杏仁苷的提取提供一種新的思路和方法。

1 儀器與試藥

JHBE—50S閃式提取器（河南金鼐科技發(fā)展有限公司）；Agilent1100液相色譜儀；BT224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；XL-60C型中藥粉碎機(jī)（湖南旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司）。

苦杏仁苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110820-201607）；苦杏仁（長(zhǎng)沙佰佳中藥飲片有限責(zé)任公司）；乙腈為色譜純；水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁苷的含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）；檢測(cè)波長(zhǎng)：207 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 將苦杏仁苷對(duì)照品干燥至恒重，精密稱量10.3 mg，放入容量瓶中，加入甲醇溶液定容至100 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為103μg·mL-1的苦杏仁苷對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將苦杏仁粉碎，過二號(hào)篩，精密稱量粉末約0.3 g，按相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件制備出提取液，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至浸膏，減壓干燥，得提取物。精密稱量提取物20 mg，放入容量瓶中，精密加入甲醇100 mL，搖勻使其完全溶解，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.1.4 HPLC法專屬性 取對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，供試品和對(duì)照品色譜圖在相應(yīng)時(shí)間有對(duì)應(yīng)色譜峰，且供試品色譜圖中苦杏仁苷色譜峰與其他組分分離良好，結(jié)果見圖1。

圖1 對(duì)照品和供試品的HPLC圖

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取干燥至恒重的苦杏仁苷對(duì)照品15.1 mg，放入容量瓶中，加入甲醇溶液定容至50 mL，搖勻。精密量取上述溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別移入甲醇至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以苦杏仁苷濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y＝9.144 8X+3.521 1，r＝0.999。表明苦杏仁苷在30.2～302μg·mL-1有良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取苦杏仁苷對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，并計(jì)算得RSD值為1.05%。表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定6次，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，并計(jì)算得RSD值為1.31%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批苦杏仁，精密稱取6份，分別按2.1.3項(xiàng)下制備成供試品溶液，并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，并計(jì)算得RSD值為1.53%。說明其重復(fù)性良好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密移取已知含量的苦杏仁6份，每份約0.15 g，加入對(duì)照品溶液適量，揮干溶液。按2.1.3項(xiàng)下制備并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，結(jié)果苦杏仁苷的平均回收率為98.56%，RSD為1.71%。說明回收率良好。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2 閃式提取工藝的考查

2.2.1 脫脂和提取次數(shù)考查 由于苦杏仁內(nèi)含有大量油脂，有文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道，提取前需進(jìn)行脫脂，所以筆者先對(duì)脫脂工藝進(jìn)行考查，同時(shí)考查提取次數(shù)。精密稱量苦杏仁粉末6份，每份約0.3 g，其中3份樣品（記為A1、A2、A3）不用石油醚脫脂，另外3份用石油醚（記為B1、B2、B3）脫脂，其余提取條件都相同：提取電壓為100 V，溶劑為70%乙醇，料液比（g∶mL）為1∶10，提取時(shí)間為1 min。按2.1.3項(xiàng)下制備并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量。結(jié)果見表2。

表2 脫脂和提取次數(shù)對(duì)苦杏仁苷提取的影響（n＝3）%

由結(jié)果可知，脫脂和不脫脂對(duì)苦杏仁苷的提取含量沒有影響；且第一次提取已將苦杏仁苷基本提取完全。所以確定提取時(shí)無(wú)須脫脂，提取次數(shù)為一次。

2.2.2 電壓強(qiáng)度的選擇 精密稱量苦杏仁粉末4份，每份約0.3 g，選取60、80、100、120 V 4種強(qiáng)度電壓進(jìn)行考查。其余提取條件都相同：溶劑為70%乙醇，料液比（g∶mL）為1∶10，提取時(shí)間為1 min，提取次數(shù)1次。按2.1.3項(xiàng)下制備并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量。結(jié)果見圖2。

圖2 電壓強(qiáng)度對(duì)苦杏仁苷提取的影響（n＝3）

由結(jié)果可知，提取電壓為100 V時(shí)提取含量最高，故選擇電壓為100 V。

2.2.3 正交試驗(yàn) 參考有關(guān)文獻(xiàn)［16-17］，并通過單因素試驗(yàn)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，選擇乙醇濃度、料液比（g∶mL）和提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選最佳工藝。因素水平表見表3，試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見表4～5。

表3 因素水平考察表

表 4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)方差分析

由表5可知，因素A（乙醇濃度）和因素C（提取時(shí)間）對(duì)提取結(jié)果有顯著性影響，而因素B（料液比）則無(wú)顯著性影響。三個(gè)因素影響的順序是A（乙醇濃度）＞C（提取時(shí)間）＞B（料液比）。綜合結(jié)果，優(yōu)選出最佳閃式提取工藝為A2B1C1，即70%乙醇，料液比1∶6，提取時(shí)間1 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)中沒有A2B1C1最佳工藝組合，為驗(yàn)證此工藝的可靠性，精密稱取苦杏仁3份，按優(yōu)選出的最佳工藝組合進(jìn)行提取，計(jì)算苦杏仁苷含量。結(jié)果分別為3.82%、3.88%、3.85%，證明此工藝合理，重復(fù)性好。

2.4 提取方法比較

采用乙醇回流法［18］和水提法［19］做為對(duì)照，采用文獻(xiàn)中所提供的方法提取苦杏仁苷，并計(jì)算含量和轉(zhuǎn)移率，與閃式提取法結(jié)果對(duì)比，結(jié)果見表6。

表6 各提取方法的比較（n＝3）

由結(jié)果可知，相比另外兩種方法，閃式提取法無(wú)論從提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比還是苦杏仁苷的含量和轉(zhuǎn)移率都較好。

3 討論

近年來對(duì)苦杏仁苷的提取研究較多，但還未見閃式提取方法的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過單因素考查和正交試驗(yàn)確定了閃式提取法的最佳工藝，即不須脫脂，提取次數(shù)為一次，電壓為100 V，溶劑為70%乙醇，料液比為1∶6，提取時(shí)間為1 min。該工藝簡(jiǎn)單、節(jié)能，苦杏仁苷的含量和轉(zhuǎn)移率都較好，有利于苦杏仁藥物的綜合利用與開發(fā)。

筆者在正交試驗(yàn)之前，對(duì)乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間3個(gè)因素分別進(jìn)行了單因素考查，得到的最優(yōu)水平分別為70%、1∶8和1.5 min，然后再選取此水平以及高低兩個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

傳統(tǒng)提取方法為水提、醇提、超聲等提取方式，水提、醇提等提取時(shí)間一般需3 h，超聲提取時(shí)間也需30min以上，而閃式提取法僅僅只需1min，大大縮短了提取時(shí)間，該方法工藝簡(jiǎn)單、高效節(jié)能。并且閃式提取法是將物質(zhì)快速破碎，通過超強(qiáng)振動(dòng)與高速攪拌讓有效成分迅速釋放出來的一種提取方法，無(wú)需加熱，不會(huì)破壞有效成分。所以閃式提取法是一種具有發(fā)展前景的新技術(shù)。

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