3種飼料添加劑對吉富羅非魚幼魚生長性能、消化酶活性和肝、腸組織結構的影響

朱傳忠，孫陸宇，解文麗，易敢峰

(1.北京大北農科技集團股份有限公司，北京 100190；2.福建大北農水產科技集團股份有限公司，福建詔安 363500;3.廈門大學海洋與地球學院，福建廈門 361005)

羅非魚是我國主要養殖品種，目前總產量位居全國淡水魚產量第五位[1]。吉富羅非魚是遺傳性狀改良的尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[2]，具有生長速度快、出肉率高的特點[3]。隨著羅非魚養殖業的快速發展，其病害問題時有發生。飼料中使用中草藥提取物[4-6]、膽汁酸[7-8]、微生態制劑[9-11]可以提高魚體生長性能，改善魚體健康，增加魚體免疫力。但這3種添加劑對吉富羅非魚生長性能和健康的影響還鮮見報道。因此，本試驗探討飼料中添加中草藥提取物、膽汁酸和微生態制劑對吉富羅非魚生長性能、腸道消化酶活性、肝臟和腸道組織結構的影響，以期為羅非魚高效環保配合飼料的配制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕、菜粕等常規原料配制成基礎飼料(見表1)。在每千克基礎飼料中分別添加1、2 g的中草藥提取物(福建大北農水產科技有限公司生產，由菌陳、大黃、郁金香等按一定比例復配后，經過超微粉碎制成)；0.1、0.2 g的膽汁酸(山東龍昌動物科技有限公司生產)；1、2 g的微生態制劑(福建大北農水產科技有限公司生產，由枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌通過閃蒸工藝制成的菌粉混合制劑)。共計配制7組飼料。試驗飼料原料均經超微粉碎，保證有80%過80目篩，混合均勻后用MY120X2雙螺桿膨化機(江蘇牧羊機械裝備有限公司)制粒，調質溫度102 ℃制粒，50～70 ℃烘干后，置于-20 ℃冰箱中儲藏備用。

1.2 試驗用魚與飼養管理

試驗用吉富羅非魚購自漳州市龍海市，運回實驗室后，用基礎飼料馴化2周，饑餓1 d后挑選大小均勻的483尾實驗魚(32.75±5.75) g，放養于21個養殖桶(有效容積500 L)中，每桶放魚23尾。試驗在循環流水養殖系統中進行，水源為曝氣自來水。日投喂率為體重的3%，每天等量投喂2次(9∶00和17∶00)，試驗周期為45 d。試驗過程中每周稱重，以此為依據調整投喂量。試驗期間水溫23～27 ℃，pH 6～8，溶氧6～8 mg/L，氨氮含量<0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.1 mg/L。

表1 基礎飼料配方與飼料營養成分含量 Tab.1 Feed formulation and nutrient contents of the experimental diets %

注：*由大北農水產科技集團生產。

1.3 樣品采集與制備

飼養試驗結束后，饑餓24 h，分別稱量每桶魚的質量。隨后，每處理組隨機撈取6尾，將魚體于冰盤中解剖，分離前腸、中腸和肝臟；肝臟、腸道(前腸、中腸)各切取0.5 cm置于Bouin氏固定液中固定；其余肝臟、腸道用液氮速凍后，放于-70 ℃冰箱保存。

1.4 指標計算、測定方法與切片觀察

飼養期間，每周測定魚體體重，每天記錄魚體攝食、死亡情況，試驗開始和結束測定魚體體重和體長。計算特定生長率、增重率、成活率、肥滿度等。

特定生長率(SGR)=(lnW2-lnW1)×100%/t

增重率(WGR)=(W2-W1)÷W1×100%

成活率(SR)= (N1-N2)÷N1×100%

肥滿度(CF，g/cm3)=(W/L3)×100

式中:W1為試驗魚初始體重(g)；W2為試驗結束時魚的終末體重(g)；t為飼養天數；N1為試驗魚初始尾數；N2為試驗魚終末尾數；W為試驗結魚的體重(g)；L為體長(cm)。

1.4.2 消化酶活性的測定方法

腸道和肝臟剪碎稱重后，以預冷的9倍體積的0.85%的生理鹽水勻漿組織。將組織液于4 ℃下3 000 r /min離心10 min，取上清液用于測定消化酶活性。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，按試劑盒說明書操作。蛋白酶的活性采用福林-酚試劑法測定；淀粉酶的活性采用碘-比色法測定；脂肪酶的活性采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測定。以37 ℃條件下，每分鐘水解干酪素生成1 μg 酪氨酸作為1 個活性單位；脂肪酶以37 ℃條件下，每毫克組織在反應體系中與底物反應1 min 消耗1 μmol 底物為1 個活性單位；淀粉酶以37 ℃條件下，每mg組織與底物作用30 min，水解1 mg淀粉為1個活性單位。

1.4.3 腸道和肝臟切片制備與分析

取合適大小的肝臟組織置于Bouin氏固定液中4 ℃過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，切片，37 ℃過夜烘干；蘇木精-伊紅染色法(HE)，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照。

腸道切片的測定指標：腸道絨毛數量；肌肉層厚度(每張圖片隨機取10個點測定后取平均值)。

1.5 數據處理與分析

實驗所得數據采用SPASS 18.0進行單因素方差分析，用Duncan氏多重比較分析組間差異顯著性。描述性統計值使用平均值±標準差表示，P< 0.05表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 3種飼料添加劑對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

試驗期間，試驗魚攝食情況良好，未發現試驗魚死亡。飼料中添加3種添加劑對吉富羅非魚幼魚生長性能和飼料利用效率的影響見表2。投喂飼料中添加0.2 g/kg膽汁酸的試驗魚增重率和特定生長率顯著高于投喂飼料中添加2 g微生態制劑，其余各組之間差異不顯著。各組間肥滿度差異不顯著。對照組飼料系數顯著高于0.2 g/kg膽汁酸組，與其他各組間差異不顯著。肥滿度在各組間差異不顯著。

表2 飼料中添加3種添加劑對吉富羅非魚生長性能的影響Tab.2 Effect of three additives on growth performance of O.niloticus

注：CK為對照組；Z1和Z2分別為中草藥1、2g/kg組；D1和D2分別為膽汁酸0.1、0.2 g/kg組；W1和W2分別為微生態制劑1、2 g/kg組，下同。

2.2 3種飼料添加劑對吉富羅非魚幼魚腸道消化酶活性的影響

飼料中添加3種添加劑對吉富羅非魚幼魚腸道蛋白酶活性的影響見表3。由表3可見，各組之間腸道蛋白酶活性差異不顯著。在投喂添加劑的試驗組中，微生態制劑組幼魚腸道蛋白酶活性最高為1 130 U/g prot，中草藥組幼魚腸道蛋白酶活性最低為890 U/g prot。從表3可以看出，雖然各處理組之間幼魚腸道淀粉酶活性差異不顯著，但攝食3種添加劑后的試驗魚腸道淀粉酶活性有升高的趨勢，且低劑量的添加劑組腸道淀粉酶活性高于高劑量添加劑組。攝食添加劑的試驗魚中，Z1和D1組的幼魚腸道淀粉酶活性最高為70 U/g prot，N2組幼魚腸道淀粉酶活性最低為40 U/g prot。在添加中草藥提取物組和添加膽汁酸組中，低劑量添加劑組幼魚腸道脂肪酶活性高于高劑量組的，膽汁酸組幼魚腸道脂肪酶活性最高為6.83 U/g prot，中草藥組幼魚腸道脂肪酶活性最低為2.59 U/g prot。飼料中添加2 g中草藥提取物使得試驗魚的腸道脂肪酶活性顯著低于微生態制劑組和飼料中添加0.1 g膽汁酸組。

表3 飼料添加3種添加劑對吉富羅非魚腸道消化酶活性的影響Tab.3 Effect of three additives on the digestive enzyme activity of O.niloticus U/g prot

2.3 3種飼料添加劑對吉富羅非魚幼魚腸道和肝臟形態的影響

2.3.1 3種飼料添加劑對吉富羅非魚幼魚肝臟形態的影響

對照組的試驗魚肝細胞排列整齊，大小均一，細胞膜分界明顯，肝細胞索明顯，肝臟細胞健康。中草藥組試驗魚肝細胞核偏移，細胞內存在大量脂肪液滴等現象；膽汁酸組試驗魚的肝細胞形態正常，兩組肝細胞形態相近；微生態制劑組的試驗魚肝細胞排列緊密，細胞核居中，細胞膜分界明顯(圖1)。

2.3.2 3種飼料添加劑對吉富羅非魚幼魚腸道形態的影響

由表4可知，在前腸組織中，攝食微生態制劑組的厚度最大，攝食飼料添加0.1 mg/kg微生態組次之，但各組間實驗魚的前腸腸道肌層厚度差異不顯著。在中腸組織中，攝食飼料中添加1 g/kg中草藥，添加0.2 g/kg膽汁酸組，而各組間也差異不顯著。前腸絨毛長度在各組間無顯著差異；1 g/kg微生態制劑組的中腸絨毛長度顯著高于中草藥組，但與其他組之間無顯著差異。

3 討論

在本試驗中，與對照組相比，飼料中添加適量中草藥提取物、膽汁酸和微生態制劑均有改善試驗魚的生長性能的趨勢，尤其是投喂添加0.2 g/kg膽汁酸的飼料顯著提高了試驗魚的增重率和特定生長率。這與對雜交羅非魚[12](O.niloticus×O.aureus)、加州鱸[13](Micropterussalmodies)、牛蛙[14]Ranacatesbeiana)的研究發現一致，分析原因可能是膽汁酸能促進脂肪乳化，擴大脂肪與脂肪酶的接觸面積，加速脂肪的消化吸收，提高脂肪利用率，而脂肪利用率的提高可以減少蛋白質作為能量被消耗，從而使更多的蛋白質用于肌體生長。

圖1 飼料中添加3種添加劑對吉富羅非魚幼魚肝臟形態的影響Fig.1 Effect of three additives on the liver morphology of juvenile O.niloticus

在本試驗中，添加1 g/kg的微生態制劑組特定生長率(SGR)有高于對照組的趨勢，但添加2 g/kg的微生態制劑的試驗魚SGR顯著低于對照組，這與錦鯉(CyprinuscarpioL.)[15]的研究結果相似，在其飼料中添加過高的微生態制劑，降低了錦鯉的生長性能，表明過量添加微生態制劑似乎對魚的生長存在負面效應。

表4 3種飼料添加劑對吉富羅非魚幼魚腸道形態的影響Tab.4 Effect of three additives on the intestinal morphology of juvenile O.niloticus

在本研究中，與對照組相比，飼料中添加中草藥提取物、膽汁酸和微生態制劑未對腸道的淀粉酶和蛋白酶活性產生顯著影響。但發現飼料中添加0.2 g/kg膽汁酸的試驗魚腸道脂肪酶活性顯著高于添加0.1 g/kg的。在對牛蛙[14]的研究中也有類似的發現，飼料中添加0.1 g/kg的膽汁酸可以顯著提高其腸道脂肪酶活性，隨著膽汁酸添加量的增加，腸道脂肪酶活力逐漸降低。

在本試驗中飼料添加膽汁酸及微生態制劑均未對肝細胞的結構產生影響。但是投喂添加中草藥提取物組的試驗魚，均發現肝細胞核位于細胞一側，細胞空泡化等現象。這可能是中草藥添加量過高或含有某種損傷肝細胞的因子所致[16]。

腸道是機體消化、吸收營養物質、免疫等的重要場所，其腸絨毛數量和腸道厚度直接影響營養物質的消化吸收[17]。本試驗中，與對照組相比，飼料中添加一定量的添加劑均有增加試驗魚的絨毛數量和肌層厚度的趨勢，這表明此3種添加劑可改善營養物質的消化吸收和腸道健康。研究發現多種添加劑都能提高腸道絨毛長度和肌層厚度，如添加10～20 mg/kg大豆黃酮可顯著促進大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸道組織結構的發育和成熟，提高其后腸腸絨毛的長度[18]；飼料中添加0.2 g/kg膽汁酸使得齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)的腸道絨毛數增加[19]。而添加50 mg/kg糖萜素(山茶科植物籽中提取的三萜皂苷類與糖類的混合物)則顯著提高大菱鲆腸道黏膜厚度[20]。

綜上所述，飼料中添加適量的中草藥提取物(1 g/kg) 、膽汁酸(0.2 g/kg) 、微生態制劑(1 g/kg)可以改善吉富羅非魚幼魚的生長性能，提高消化酶活性。

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