基于DNA條形碼技術的永暑礁瀉湖魚卵鑒定研究

吳 娜，張 楠，曹 明，郭華陽，朱克誠，楊靜文，江世貴，張殿昌

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點開放實驗室，廣州 510300；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3.廣東省漁業(yè)種質保護中心，廣州 510300)

魚卵和仔稚魚是魚類生活史的早期階段，魚卵和仔稚魚調查是研究魚類繁殖習性、生殖洄游路線、產卵場、種類分布和種群動態(tài)的基礎，也可為魚類人工繁育技術和生理生化機制研究提供基礎數據[1]。魚卵和仔稚魚種類的準確鑒別，是開展魚卵和仔稚魚研究的重要前提。通常，魚卵鑒別主要依據卵的形狀、大小、卵周隙、油球、內膜、絨毛膜、卵黃形態(tài)和胚胎形狀等形態(tài)特征[2]，然而近緣物種的魚卵由于形態(tài)相似很難區(qū)分，大多種類只能鑒定到科或屬的水平，目前只有極少種類魚卵鑒定到種的水平，尋求穩(wěn)定、準確的分類依據和鑒定方法，是魚類浮游生物研究亟待解決的關鍵問題。DNA條形碼(DNA barcoding)技術是一種利用標準基因區(qū)域序列多態(tài)性進行物種鑒定的分子方法，條形碼序列分析不依賴于形態(tài)特征，對形態(tài)特征近似，形態(tài)學分類比較困難的疑難種類的分類以及形態(tài)學分類上存有疑問種類的驗證提供了新的方法和手段[3-4]。魚類線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(mtCOI)基因具有序列變異水平適中，變異區(qū)域兩端序列高度保守和序列長度適宜的特點，是被廣泛接受的魚類DNA條形碼標準基因[5-7]，目前魚類DNA條形碼數據庫(Barcode of Life Data System [BOLD])中已有超過17.5萬件憑證標本，代表了1.5萬種以上的魚類種類[8]。隨著魚類DNA條形碼數據庫的不斷完善，研究證實DNA條形碼技術在魚卵和仔稚魚的種類鑒定中也具有重要的應用價值[9-11]。

南沙群島位于南海南部，屬于印度洋-太平洋熱帶動物區(qū)系，是世界上海洋生物最豐富的區(qū)域之一。根據已有的調查資料顯示南海魚類有3 000多種，分別隸屬于3個綱、35個目、236個科和822屬[12]。目前南海魚類中只對極少數種類的魚卵和仔稚魚進行過研究[4，13-14]，絕大多數種類的魚卵和仔稚魚的形態(tài)特征并不清楚，使得南海重要經濟魚類產卵行為、產卵場判別和種群補充機制研究無法開展。永暑礁是一座珊瑚環(huán)礁，為珊瑚礁魚類和熱帶大洋性魚類的重要產卵場，然而目前未見有關永暑礁海域魚卵鑒定和分類的相關研究。因此，本研究擬以永暑礁瀉湖魚卵為研究對象，采用形態(tài)分類特征和DNA條形碼技術對采集的魚類進行鑒定分析，以期了解珊瑚礁魚類和熱帶大洋性魚類的產卵季節(jié)和種類分布特征，為相關種類的種群補充機制研究提供基礎材料。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和形態(tài)特征分析

依托中國水產科學研究院南海水產研究所“南鋒號”科學調查船，于2016年4月13號在中國南海永暑礁瀉湖海域按照《海洋調查規(guī)范》(GB12763.1-7-91)進行魚卵樣品采集。采用孔徑為0.505 mm篩絹制成的大型浮游生物網(網口內徑80 cm、長270 cm、網口面積為0.5 m2)按照設定站位進行表層水平和垂直拖網，采集魚卵樣品，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２杉臉悠愤\至實驗室后，于解剖鏡下進行形態(tài)特征觀察和顯微拍照，觀察記錄魚卵的卵膜(Chorion)、圍囊腔(Perivitelline space)、卵黃(Yolk)、油球(Oil globule)、色素分布(Pigmentation)和胚體發(fā)育(Embryo)等形態(tài)特征和魚卵卵徑參數，并對魚卵形態(tài)特征進行了描述分析(表1)。

1.2 DNA提取和COI基因測序分析

魚卵樣品用雙蒸水沖洗，將樣品置于1.5 mL離心管中，采用Magen公司的試劑盒(HiPure Mollusc DNA Kit)提取基因組DNA，提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镌O計參照Ward等[15],由廣州睿博生物公司合成，序列擴增引物為Fish-F：5′-TCRACYAAYCAYAAAGAYATYGGCAC-3′和Fish-R：5′-ACTTCWGGGTGRCCRAAGAATCA-3′。PCR擴增總體積為25 μL，反應體系包括RNase-Free Water (16.7 μL)，10×loading buffer (Mg2+free)2.5 μL，DNTP(2.5 mmol/L)2 μL，MgCl2(2.5 μmol/L)1.5 μL，F(xiàn)ish-F(10 μmol/L)0.5 μL，F(xiàn)ish-R(10 μmol/L)0.5 μL，rTaq (5 U/μL)0.3 μL及DNA模板(20 ng/μg)1.0 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物進行1.2%的瓊脂糖膠電泳檢測，選取擴增結果較好的產物送廣州睿博興科股份有限公司測序分析。

由于魚卵樣品在提取DNA、PCR擴增及測序的實驗過程中，都有可能會出現(xiàn)結果不佳的情況，因此本研究以最終獲得的有效的序列個體來進行分析。

1.3 分子鑒定分析

測序獲得的魚卵COI基因序列與BOLD系統(tǒng)數據庫(http://www.barcodinglife.org)比對分析進行物種鑒定，在比對分析中，BOLD系統(tǒng)為每個樣品分配一個條形碼索引號(Barcode Index Number，BIN)，當樣品COI基因序列與BIN中參考序列的相似性≥98.4%時，鑒定為種，當相似性在95%～ 98.3%之間，鑒定到屬，當相似性<95%時，為未知種[2，16]。利用MEGA6.0軟件根據配對遺傳距離采用Kimura two-parameter model (K2P)構建鄰接進化樹(Neighbor-joining tree)[17]，進化樹末端節(jié)點代表了種類分組。

2 結果和分析

2.1 魚卵種類鑒定分析

采集的71個魚卵樣品根據外部形態(tài)特征初步劃分為圓形和橢圓形2種類型，圓形魚卵44個，橢圓形魚卵27個。經DNA提取和線粒體COI基因片段測序分析，71個魚卵樣品中的30個個體獲得了有效的線粒體COI序列信息，測序成功率為42.3%。44個圓形魚卵中有27個測序成功，測序成功率達61.4%；27個橢圓形魚卵中有3個測序成果，測序成功率僅為11.1%。30個魚卵線粒體COI序列分別于BOLD數據庫比對分析，結果顯示與BOLD數據庫中參考序列相似性在99.6～100%之間，30個魚卵均能鑒定到種的水平，分屬于1個目，7個科，13個種(表1，表2)。刺尾魚科(Acanthuridae)有5個種，分別為白面刺尾魚(Acanthurusnigricans)、扁體櫛齒刺尾魚(Ctenochaetusstrigosus)、雙斑櫛齒刺尾魚(C.binotatus)、白尾櫛齒刺尾魚(C.flavicauda)和黑背鼻魚(Nasolituratus)，共有19個魚卵，占鑒定魚卵總數的63.3%。鸚哥魚科(Scaridae)有2個種，分別為史氏鸚哥魚(Scarusschlegeli)和斑點鯨鸚哥魚(Cetoscarusocellatus)。隆頭魚科(Labridae)有2個種，分別為單帶尖唇魚(Oxycheilinusunifasciatus)和雙線尖唇魚(O.digramma)。鲹科(Carangidae)有1個種為藍圓鲹(Decapterusmaruadsi)；籃子魚科(Siganidae)有1個種為銀籃子魚(Siganusargenteus)；笛鯛科(Lutjanidae)有1個種為欖色細齒笛鯛(Aphareusfurca)；鰈魚科(Zanclidae)有1種為鐮魚(Zancluscornutus)。雙斑櫛齒刺尾魚有10個魚卵，白尾櫛齒刺尾魚有4個魚卵，這兩個種為該海域的優(yōu)勢種類，其余各種類均為1～2個魚卵。

表1 13種魚卵的形態(tài)特征Tab.1 Morphological features of 13 species of fish eggs

續(xù)表1

表2 南海永暑礁海域魚卵mtCOI序列比對結果Tab.2 Sequences comparison results of mtCOI in fish eggs from Yongshu reef lagoon of South China Sea

2.2 系統(tǒng)進化分析

獲得的30個魚卵的線粒體COI序列長度在463～662 bp之間，序列中沒有插入/缺失位點和終止密碼子。根據線粒體COI序列計算種內的K2P遺傳距離為0～0.002，同一個屬種間的遺傳距離為0.004～0.132，而同一個科不同屬間的遺傳距離為0.117～0.185。根據K2P模型利用遺傳距離構建的鄰接系統(tǒng)進化樹顯示，相同的種類聚為一個分支；刺尾魚科中的刺尾魚屬和櫛齒刺尾魚屬聚為一支，而與同一科的鼻魚屬未形成單系支(圖1)。

圖1 根據K2P模型利用遺傳距離構建的鄰接系統(tǒng)進化樹Fig.1 Neighbor-joining tree constructed based on K2P model

2.3 魚卵形態(tài)特征分析

根據魚卵的形狀、卵膜、圍囊腔、卵黃、油球、色素分布和胚胎發(fā)育情況等形態(tài)性狀，詳細描述了該研究鑒定的13種魚類的魚卵形態(tài)特征(表1)。史氏鸚哥魚和藍圓鲹的魚卵均為橢圓形，卵膜光滑，無色透明，圍囊腔較寬，但是史氏鸚哥魚卵徑較大，卵黃均勻分布，而藍圓鲹的卵黃位于魚卵的一端，并且體積較小。其余11種魚類的魚卵均為圓形，魚卵直徑在1.34～1.99 mm之間，黑背鼻魚的魚卵直徑最小，鐮魚的魚卵直徑最大。已有的研究表明海水魚卵直徑在0.5～5.5 mm之間[18]，該研究所獲得的永暑礁海域魚卵直徑也處于該范圍，但是比尤卡坦半島(Yucatan Penisula)海域魚卵直徑大[2]，可能是由于其將魚卵保存于酒精中導致魚卵縮水造成的，而該研究是將魚卵樣品直接冷凍保存。

3 討論

近年來，由于過度捕撈和填海造島等人類活動干擾，漁業(yè)生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，導致漁業(yè)資源顯著減少[19]。對魚卵進行準確鑒別是了解魚類繁殖習性、生活史和種群動態(tài)的基礎，可用于鑒別魚卵的形態(tài)特征較少，傳統(tǒng)的分類手段很難準確鑒別到種的水平。永暑礁為典型的珊瑚環(huán)礁，是熱帶珊瑚礁魚類的重要棲息地和產卵場，目前未見有關永暑礁魚卵分類鑒別的相關文獻報道。DNA條形碼技術的迅速發(fā)展，為從分子水平準確鑒定魚卵提供了有效的手段[10,20]。從魚卵中提取高質量的DNA用于PCR擴增，是利用DNA條形碼鑒別魚卵的前提條件，該研究分析的71個冷凍保存的魚卵中30個成功擴增測序獲得了有效的線粒體COI序列信息，成功率為42.3%。部分魚卵未能成功獲得COI序列，可能由于魚卵樣品為冰凍保存，樣品在凍融過程中降解，導致無法提取其基因組DNA，或者由于魚卵樣品體積較小，在DNA提取過程中操作不當導致樣品損失，因此，魚卵樣品保存和基因組DNA的提取需要進一步的優(yōu)化，提高魚卵鑒定的檢出率。有趣的是圓形魚卵的擴增測序成功率(61.4%)顯著高于橢圓形魚卵的擴增測序成功率(11.1%)，其中原因有待于進一步研究。酒精保存魚卵容易導致魚卵脫水，致使魚卵縮小變形，但是酒精保存不需要特殊的設備，容易操作，也是目前魚卵采集過程中的主要保存方式之一，Leyva等[2]研究表明酒精保存的魚卵DNA條形碼測序成功率為46.3%，Burghart等[9]的研究表明50%的異丙醇保存魚卵也不影響樣品用于DNA條形碼分析。由此可見目前魚卵的擴增成功率并不高，如何開發(fā)高效的魚卵保存和擴增方法是有待進一步研究的問題。

近年來有關魚類DNA條形碼參考序列數據庫構建得到了快速發(fā)展，Díaz等[21]采集分析了79種魚類樣品，測序分析了其DNA條形碼序列，構建了美洲Lower Paraná河魚類DNA條形碼參考序列數據庫；Chang等[22]采集分析了1 245種魚類憑證標本及其DNA條形碼序列，構建了臺灣海峽魚類DNA條形碼參考序列數據庫；Weight等[23]采集分析了521種魚類樣品及其DNA條形碼序列，構建了加勒比海魚類DNA條形碼參考序列數據庫；中國水產科學研究院依托國家科技基礎工作專項采集分析了763種南海魚類憑證標本及其DNA條形碼序列，構建了較為完備的南海珊瑚魚類DNA條形碼數據庫，這些序列均已錄入到BOLD條形碼數據庫中，這些條形碼序列數據庫的建立為基于DNA條形碼技術開展魚卵和仔稚魚鑒定奠定了基礎。北大西洋大陸架海域93.26%的魚卵DNA條形碼序列能夠與BOLD數據庫中的參考序列相匹配[8]，在加勒比海珊瑚礁海域僅有85.7%的魚卵DNA條形碼序列能夠與BOLD數據庫中的參考序列相匹配[2]，該研究中100%的魚卵DNA條形碼序列能夠與參考數據庫中的序列相匹配。這些研究結果表明DNA條形碼參考數據庫的完整性直接影響到魚卵鑒定的效率。

由于線粒體COI基因存在同義突變偏好性，不同種屬間的突變率存在顯著差異[24]，致使種內或種、屬間的線粒體COI序列多態(tài)性存在顯著差異，這種差異稱為條形碼間隙(Barcode gap)[25]，DNA條形碼間隙的存在是利用條形碼進行物種鑒定的前提，已有的關于魚類DNA條形碼研究證實魚類種內或種、屬間存在顯著的條形碼間隙[22,26]。該研究表明永暑礁同種魚類間的K2P遺傳距離為0～0.002，同一個屬不同種間的遺傳距離為0.004～0.132，屬間的遺傳距離為0.117～0.185，存在著明顯的DNA條形碼間隙，分析的所有種類在NJ進化樹中均能形成單系支，證實了DNA條形碼技術適用于南海珊瑚礁魚類魚卵和仔稚魚鑒定。該研究中南沙珊瑚礁魚類種內遺傳距離最高僅為0.002，顯著低于墨西哥尤卡坦半島魚類種內遺傳距離(0.006)[2]和臺灣海峽魚類種內遺傳距離(0.151)[21]，可能與該研究中每個種類使用魚卵的數量較少有關，下一步應加大魚卵采集和分析的數量，以便更準確反映種內和種屬間的遺傳關系。

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