PAR激活在哮喘發生中作用機制的研究進展

尹藝曉，張發艷，周生余

(1山東中醫藥大學中醫學院，濟南250355；2山東大學護理學院)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等)和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。近年來我國哮喘的發病率逐年上升，已成為嚴重威脅居民身體健康和生活質量的公共衛生問題之一。2014年全球哮喘防治創議第一次明確指出，哮喘是一種異質性疾病，其發病機制復雜，至今尚不完全清楚。氣道炎癥是哮喘最基礎的病理改變，氣道高反應、可逆性氣流受限及氣道重塑往往是氣道炎癥所引起的級聯反應。因此，不管是哮喘的急性發作期還是慢性緩解期，控制氣道炎癥均是治療的關鍵。蛋白酶激活受體(PAR)屬于G蛋白偶聯受體家族成員，被凝血酶、組織因子等激活后，通過G蛋白偶聯系統活化PKC等一系列信號轉導通路，產生各種細胞因子和炎性介質，繼而介導炎癥反應。目前，PAR在哮喘氣道炎癥反應中的作用越來越受到關注。本文結合文獻就PAR激活在哮喘發生中作用機制的研究進展作一綜述。

1 PAR概述

1991年Vu等首次分離出了PAR，并得到功能性人類凝血酶受體的cDNA，同時對該受體結構和功能進行了闡述。目前認為，PAR是一組具有7個跨膜單位的G蛋白偶聯受體超家族，由細胞外N端、3個細胞外袢、7個疏水跨膜區、3個細胞內袢和細胞內C端構成。PAR包括4種亞型，即PAR1、PAR2、PAR3、PAR4，廣泛存在于全身各種組織細胞表面。其中，PAR1主要分布于血小板、內皮細胞、上皮細胞、肌細胞、成纖維細胞、神經元和星形膠質細胞中；PAR2主要分布于上皮細胞、內皮細胞、成骨細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、神經元、肌細胞和星形膠質細胞中；PAR3和PAR4主要分布于血小板、內皮細胞、星形膠質細胞、肌細胞、肺泡巨噬細胞和中性粒細胞。

PAR可被多種內源性、外源性蛋白酶和凝血因子等激活。PAR1的配體主要為凝血酶、FⅩa、激活蛋白C、激肽釋放酶、顆粒蛋白酶、基質金屬蛋白酶等；PAR2配體主要為凝血因子FⅩa、組織因子凝血因子復合物、胰蛋白酶、類胰蛋白酶、肥大細胞纖維蛋白溶酶及凝血酶激活PAR1產生的栓系配體等；PAR3和PAR4配體均為凝血酶。目前認為，PAR有兩種激活方式，一種方式需要先形成一個新配體，即凝血酶或其他蛋白酶等配體與細胞外水蛭樣結構域結合，裂解其胞外的N末端，釋放出一個多肽后，暴露一個新的氨基端，此為新配體，該配體再與受體膜外的第2個胞外袢結合，最終激活PAR；另一種方式為一般受體激活形式，即與栓系配體相對應的PAR激活肽結合，直接激活細胞膜表面的PAR。激活后的PAR通過G蛋白偶聯系統，主要是胞內異三聚體或小分子量G蛋白，促進Ca2+釋放，活化PKC等信號傳導通路，引起信號級聯反應，繼而影響細胞形態、分泌、代謝和運動等。在呼吸系統中，PAR主要分布于肺泡上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和肺腫瘤細胞等。在生理或病理狀態下，氣道上皮細胞均表達PAR1、PAR2和PAR4，病理狀態下尤為明顯。激活后的PAR可通過相應信號轉導通路介導多種細胞因子釋放，參與炎癥反應，繼而導致肺組織損傷，在炎癥性肺疾病中具有重要作用[1]。

2 PAR在哮喘發生中的作用

哮喘是一種以氣道高反應性、可逆性氣流受限、氣道重塑為特征的慢性氣道炎癥性疾病。氣道長期慢性炎癥損傷導致的氣道上皮纖維化、平滑肌增生肥大等，是哮喘發生、發展及晚期不可逆性改變的病理基礎[2]。因此，氣道炎癥是哮喘最基礎的病理改變。氣道慢性炎癥不僅導致各種凝血因子形成、纖維蛋白沉積和纖溶異常，氣道壁水腫而加重氣道狹窄，使哮喘癥狀加重[3]，還可激活PAR，繼而影響炎性細胞和細胞因子，最終導致氣道重塑[4，5]。

2.1 PAR激活對炎性細胞的影響 目前認為，多種炎性細胞參與了哮喘的發病過程，如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、上皮細胞等。

2.1.1 嗜酸性粒細胞 嗜酸性粒細胞是哮喘氣道炎癥反應的關鍵效應細胞，其被激活后能釋放許多炎性介質和細胞因子，包括氧自由基、白三烯、白細胞介素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等以及具有細胞毒性的嗜酸性細胞陽離子蛋白、嗜酸性細胞過氧化物酶和主要堿基蛋白等，這些物質均參與炎癥反應，繼而引起氣道上皮損傷，增加氣道高反應性[6]。在許多過敏性氣道疾病的動物模型中發現，PAR2激活可增加和活化炎性細胞，尤其是嗜酸性粒細胞。在蟑螂提取物誘導的氣道高反應小鼠和氣道重塑BALB/c小鼠模型中發現，PAR2拮抗劑可顯著降低模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞數量和肺組織膠原蛋白成分[7]，而PAR2基因敲除小鼠肺泡內嗜酸性粒細胞和肺泡蛋白漏出液明顯減少[8]。對蟑螂蛋白提取物測序分類發現了3種絲氨酸蛋白酶，這些蛋白酶均能夠通過PAR2受體激活鈣離子和MAPK信號通路[9]。

2.1.2 肥大細胞 肥大細胞屬于非特異性免疫細胞，與速發性哮喘的發生關系密切。肥大細胞能驅動過敏反應，激活后脫顆粒釋放的類胰蛋白酶能高效誘導中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤,增加氣道微血管通透性,刺激氣道上皮細胞釋放組織胺、白三烯和IL-8等多種生物活性成分和炎性介質。肥大細胞膜上的PAR2激活后可促進IL-18釋放，而IL-18又促進肥大細胞聚集和PAR2表達增加[10]。因此，PAR2可間接對肥大細胞產生影響。

2.1.3 上皮細胞 研究發現，上皮細胞也能參與哮喘的發病過程。利用高致敏原鏈格孢菌濾液作用于人氣道上皮細胞，可通過激活PAR2，使體外細胞內鈣離子濃度迅速升高和體內炎性細胞募集，而相關拮抗劑可阻斷這種反應，提示PAR2可能通過影響炎性細胞而參與過敏性哮喘的發生[11]。

由于PAR2可影響嗜酸性粒細胞、肥大細胞、氣道上皮細胞和單核細胞等多種細胞功能，誘導哮喘氣道炎癥的發生、發展。因此，有學者認為單核細胞PAR2表達情況可判斷哮喘患者病情，有可能成為哮喘病情評價的生物標志物[12]。

2.2 PAR激活對細胞因子的影響 細胞因子是引起或加重哮喘氣道炎癥反應的關鍵因素。目前普遍認為，哮喘是一種Th1型細胞與Th2型細胞失衡的炎癥性疾病，Th1型細胞減少、Th2型細胞增加是哮喘發病的一個重要機制。一些過敏原和裂解酶通過激活PAR2，活化呼吸道上皮細胞、肥大細胞、中性粒細胞等使其釋放多種細胞因子，引起或加重氣道炎癥反應。有學者將煙曲霉提取物作用于支氣管上皮細胞，通過激活PAR2和蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型信號通路，抑制Th1型細胞生成，使Th2型細胞占優勢，繼而在哮喘發病中發揮重要作用[13]。

2.2.1 促進IL-6、IL-8等炎性介質釋放 研究證實，含有蛋白酶提取物的灰塵作用于人類支氣管上皮細胞可激活PAR1和PAR2，通過PKC激酶途徑促進支氣管上皮細胞釋放包括IL-6、IL-8、TNF-α及趨化因子CXCL1、CXCL2等多種炎性介質，在氣道炎癥性疾病中發揮重要作用[14]。IL-6是刺激T、B細胞生長和分化、促進細胞毒性淋巴細胞功能、誘導急性期炎癥反應的重要細胞因子；通過促進Th2型細胞比例增加，抑制Th1型細胞分化參與哮喘氣道炎癥反應過程。作為趨化因子的IL-8主要趨化和激活中性粒細胞，使炎癥細胞向氣管募集、遷移或浸潤，并促進白三烯分泌，繼而引起支氣管收縮。Jairaman等[15]采用塵螨和蟑螂的提取物刺激支氣管上皮細胞，發現至少能部分通過激活PAR2，引起細胞內質網鈣釋放激活的鈣通道調控因子STIM1蛋白和Orai1蛋白活化，鈣離子進入細胞后激活鈣調神經磷酸酶/活化T細胞核因子(NFAT)信號轉導通路，通過NFAT蛋白的脫磷酸化及核內轉位，激活下游細胞因子IL-6和IL-8基因的轉錄。Ramu等[16]采用房屋塵螨、鏈格孢菌、艾蒿和歐洲白樺四種物質的提取物作用于支氣管上皮細胞，發現這些物質可通過激活PAR，劑量依賴性釋放ATP和IL-8，而絲氨酸蛋白酶抑制劑可抑制上述過敏原誘導的IL-8 mRNA表達。以上研究表明，不同過敏源均通過PAR激活不同的信號轉導通路誘導細胞因子IL-6、IL-8等產生，在哮喘的發病機制中發揮重要作用。

2.2.2 促進單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)和粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)釋放 研究證實，MCP-1對單核細胞、T淋巴細胞、嗜堿性粒細胞等有趨化和激活作用，并可導致肥大細胞脫顆粒。GM-CSF可刺激髓樣單核細胞生長和分化，激活巨噬細胞，刺激嗜酸性粒細胞分化和發育，使嗜酸性粒細胞釋放大量白三烯和堿性蛋白，繼而損傷呼吸道上皮，加重哮喘癥狀。Lee等[17]利用表皮塵螨提取液刺激中性粒細胞，發現塵螨提取液可激活PAR2，通過PAR2/PI3K/Akt/ERK/NF-κB信號途徑轉錄表達MCP-1和GM-CSF，但塵螨提取液還具有抗中性粒細胞凋亡作用。因此，PAR及其信號通路是否與中性粒細胞哮喘表型有一定關系尚需進一步研究。

2.2.3 促進TNF-α和IL-18釋放 TNF-α亦是一種具有誘導炎癥反應和調節免疫反應的重要細胞因子，可作用于血管內皮細胞，誘發IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子釋放，促進炎癥細胞黏附、游走、浸潤及中性粒細胞脫顆粒，導致氣道炎癥反應加重和氣道高反應性。Kim等[18]利用德國蟑螂提取物體外作用于肺泡巨噬細胞，發現PAR2被激活并能刺激細胞釋放TNF-α；在哮喘模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13水平均升高。IL-18與PAR2激活亦存在相關性。IL-18是與哮喘炎癥反應，尤其是肥大細胞募集有關的細胞因子，該細胞因子可誘導巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸粒細胞浸潤，并刺激Th2型細胞因子和IgE產生。在中度和重度哮喘小鼠模型中，IL-18和類胰蛋白酶均明顯升高，二者密切相關；類胰蛋白酶能通過肥大細胞上的PAR2促進IL-18釋放，而IL-18又可促進IL-4水平升高、肥大細胞聚集和PAR2表達增加[10]。

2.3 PAR激活對氣道重塑的影響 研究證實，促炎因子長期持續存在可導致氣道平滑肌細胞增殖、細胞外基質沉積，最終出現氣道重塑，繼而影響肺功能。PAR2激活具有促進支氣管平滑肌細胞增殖作用。Allard等[19]對來源于哮喘患者的氣道平滑肌細胞給予PAR2激動劑干預，發現細胞增殖能力明顯增強，且隨著作用時間延長效果更明顯；進一步研究發現，這種增殖作用與激活ERK1/2磷酸化通路有關。因平滑肌細胞是氣道重塑的關鍵細胞，由此推測PAR2對氣道重塑有一定作用，這可能為今后難治性哮喘的治療提供了新思路。

目前，關于PAR1對氣道重塑影響的研究報道相對較多。人氣道平滑肌細胞PAR1被凝血因子Ⅹa激活后，在膜聯蛋白A2、整合蛋白和整聯蛋白參與下，刺激細胞產生IL-6、細胞周期蛋白D1、纖維生長因子2、血小板源性生長因子B、結締組織生長因子等，上述細胞因子均參與氣道重塑，在哮喘發生、發展中發揮重要作用[20]。PAR1通過促進氣道組織TGF-β高表達而加劇氣道重塑。TGF-β一直被認為是氣道重構的關鍵因素，不僅能促進氣道上皮細胞增生、上皮下膠原沉積和纖維化，還能促使上皮細胞向間質細胞轉化。在小鼠哮喘模型氣道組織中發現，PAR1 mRNA和蛋白表達明顯升高，PAR1激活后通過ERK1/2信號轉導通路，使上皮細胞中TGF-β表達升高，并促進上皮細胞向間質細胞轉化，導致氣道重塑[21，22]。Gong等[23]研究發現，在卵清蛋白誘導的小鼠哮喘模型中，TGF-β使上皮細胞鈣黏蛋白向神經鈣黏蛋白及α-平滑肌動蛋白(α-SMA)轉化也是通過激活PAR1實現的，而PAR1拮抗劑可恢復上皮細胞鈣黏蛋白活性而抑制α-SMA表達，阻止纖維化發生。另有研究發現，哮喘患者氣道組織TGF-β和基質金屬蛋白酶高表達造成的氣道重塑和持續氣流受限是重癥哮喘或激素治療效果不佳的一個重要原因[24]。深入研究PAR1、PAR2或其信號通路可能對重癥或難治性哮喘的治療有一定幫助。

綜上所述，PAR激活，尤其是PAR2和PAR1激活可通過多種信號轉導途徑促進炎性細胞和細胞因子大量產生，造成氣道慢性炎癥反應和氣道重塑，引起或加重哮喘。深入研究PAR在哮喘發病機制中的作用及研發PAR阻斷劑將有望為哮喘的預防、控制及治療帶來希望。