細胞焦亡發生機制及其相關疾病的研究進展

石明霞,謝美玉,郭順利,周素芳

(廣西醫科大學基礎醫學院, 南寧530021)

模式識別受體(PRR)與病原體相關分子模式(PAMP)的相互識別和作用是機體啟動固有免疫應答的關鍵。PAMP是一類或一群特定的微生物病原體(及其產物)所共有的可被非特異性免疫細胞所識別的、高度保守的分子結構。PRR是一類主要表達于固有免疫細胞表面、能識別一種或多種PAMP的模式識別分子。炎癥小體是一種由機體PRR參

與組成的多蛋白信號復合物，模式識別受體與特定配體結合，再與其他蛋白結合形成炎癥小體復合物。每個炎癥小體包含1個Caspase的激活和募集域(CARD)和/或1個熱蛋白結構域(PYD)。Caspase-1與這些炎癥小體通過結構域與結構域(PYD-PYD，CARD-CARD)結合的方式被激活。病原體入侵時，含有CARD結構域的炎癥小體直接募集pro-Caspase-1，并使2個相鄰pro-Caspase-1發生自身水解，產生具有酶活性的Caspase-1，活化的Caspase-1通過切割白細胞介素-1β(IL-1β)和 IL-18前體將其轉化為活性形式并分泌至細胞外，最終誘發細胞焦亡[1]。不含CARD結構域的炎癥小體，則通過含CARD結構域的凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)募集pro-Caspase-1[2]。非經典細胞焦亡通路則通過Caspase-4/5/11直接識別并結合細菌脂多糖(LPS)而激活。活化的Caspase-1/4/5/11將GSDMD蛋白切割為具有成孔活性的N端(GSDMD-N)，GSDMD-N在細胞膜上打孔引起細胞焦亡。現就細胞焦亡的分子機制、細胞焦亡相關疾病的研究現狀及進展作一綜述。

1　細胞焦亡與細胞凋亡的區別

細胞程序性死亡是機體免疫自穩的重要部分，能清除不需要的細胞。細胞凋亡與細胞焦亡均是細胞程序性死亡的方式，但二者在發生機制、細胞形態學及生物學效應等方面不同[3]。細胞凋亡由凋亡相關胱天蛋白酶(如Caspase-3/8/9)介導，細胞發生非炎癥性壞死。細胞發生凋亡時，細胞質和細胞核固縮、DNA裂解、細胞膜保持完整。而細胞焦亡是炎性胱天蛋白酶( Caspase-1/4/5/11)介導的炎癥性細胞壞死，細胞焦亡過程中細胞膜形成孔洞，細胞逐漸膨脹破裂，內容物釋出，激發強烈的炎癥反應[5]。

2　細胞焦亡激活機制

2.1經典細胞焦亡通路細胞焦亡通路中的PRR包括 NOD樣受體(NLRs)NLRP1、NLRP3和NLRC4/NAIP及黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)等[6]。ASC是一種接頭蛋白，包含1個PYD和1個CARD結構域。NLRP1、NLRC4等炎癥小體含有CARD結構域，可直接與Caspase-1結合，進行信號傳導；僅含有PYD的炎癥小體(如NLRP3、AIM2)需通過特殊接頭蛋白ASC進行信號傳導，ASC中的CARD可通過CARD-CARD相互作用募集Caspase-1[7]。

2.1.1細胞焦亡通路中的特殊接頭蛋白ASC ASC是一種含有N端PYD和 C端CARD的接頭分子。ASC含有的PYD結構域和CARD結構域通過自身的寡聚化來募集上下游與其含有同源結構域的其他蛋白(如NLRP3,Caspase)，形成一個穩定的蛋白復合物，即炎癥小體，從而在經典的細胞焦亡通路中發揮重要作用。

2.1.2NLRP3炎癥小體 NLRP3炎癥小體屬于NLR家族，由NLRP3、ASC及pre-Caspase-1組成[8]。NLRP3包含配體感應和自身調節的富含亮氨酸重復序列(LRRs結構域)；介導NLR寡聚化的核苷酸結合寡聚化結構域(NACHT)；以及調節下游信號傳導的N端PYD結構域。NLRP3的PYD結構域能與ASC的PYD結構域結合，通過ASC的接頭作用招募并激活Caspase-1。機體受到外來刺激時，NLRP3與ASC結合，并募集Caspase-1前體組裝NLRP3炎癥小體，同時活化Caspase-1，誘導細胞發生焦亡[3～6]。

2.1.3Pyrin炎癥小體 Pyrin蛋白是由MEFV(地中海熱)基因編碼的含PYD的蛋白，能間接識別艱難梭菌，副溶血弧菌及其他腸道致病菌的細菌毒素/效應蛋白。不同于其他炎癥小體， Pyrin并不直接識別和結合病原微生物分子，而是間接感受細菌的毒力而發揮作用。Pyrin主要通過感知各種細菌毒素對宿主細胞Rho家族小G蛋白的修飾和失活，進而以PYD-PYD結合的方式與ASC蛋白進行組裝，形成炎癥小體復合物，在介導細胞天然免疫中發揮重要作用[9]。

2.1.4NLRC4炎癥小體NLRC4屬于NOD樣受體家族，主要感受細菌的鞭毛蛋白和Ⅲ型分泌系統等成分，在機體免疫應答中發揮重要作用[12]。病原體刺激時，處于靜息狀態的NLRC4會被NAIP亞家族蛋白識別并激活，從而發生自身多聚化并招募Caspase-1，形成炎癥小體，引發一系列免疫應答效應[11]。NAIP是一類能直接識別和結合來自病原菌的不同配體分子的具有BIR結構域的新型NOD樣受體分子。實驗證明 NAIP5和 NAIP6能特異性識別并直接結合病原菌的鞭毛蛋白分子，然后通過和 NLRC4相互作用引發免疫應答[12]。NLRC4蛋白以“自我復制”的方式被激活并發生寡聚化，能敏感感知外界危險信號，快速啟動免疫應答[13]。

2.1.5NLRP1炎癥小體 小鼠表達3種同系物，NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c，人類僅表達 NLRP1。NLRP1包含1個PYD結構域(位于N末端)、1個LRR結構域、1個功能發現結構域 FIIND和1個CARD結構域(C末端)，可與Caspase-1的CARD結構域之間直接結合，從而激活 Caspase-1[4]。

2.1.6AIM2和IFI16炎癥小體AIM2和IFI16是ALR家族的成員，能誘導Caspase-1的活化和細胞因子IL-1β的成熟。AIM2是細胞質中細菌或病毒來源的dsDNA受體[14]。ALR炎癥小體通過HIN-200結構域直接識別并結合其配體-dsDNA。細菌雙鏈DNA結合后到AIM2的C端HIN200域，AIM2的N端中的PYD與ASC中的PYD相互作用，激活Caspase-1。IFI16同AIM2一樣，不含CARD結構域，需通過 PYD來募集 ASC激活炎癥小體[15]，且 IFI16可能在識別病毒雙鏈DNA并促進干擾素γ的產生過程中發揮作用。

2.2非經典細胞焦亡通路 非經典細胞焦亡通路由Caspase-4/5/11引發。Caspase-4/5/11均屬于炎癥性Caspase家族，這類Caspase的CARD結構域能直接識別并結合 LPS，并發生自身寡聚化進而表現出明顯的蛋白酶活性[16]。 LPS激活的Caspase-11/4/5在 N末端和 C末端結構域間的接頭內切割 GSDMD， 從而釋放具有成孔活性的 N端結構域(GSDMD-N)，GSDMD-N通過結合膜磷酸肌醇轉移到質膜，在膜上穿孔引起細胞溶脹和滲透裂解。

Pannexin-1是縫隙連接半通道蛋白，控制漿膜上小分子物質進出。Pannexin-1在ATP誘導的針對LPS進行的免疫應答導致的細胞焦亡過程中起重要作用。在非經典炎癥小體通路中Caspase-11的激活導致Pannexin-1的斷裂和Pannexin-1依賴性ATP通道的開放，從而介導細胞焦亡[17]。裂解的Pannexin-1可打開自身通道以釋放ATP，從而激活P2X7受體。P2X7受體是一種允許Na+和Ca2+內流的非選擇性陽離子通道。受到ATP長時、反復刺激時，P2X7通道開放引起K+、Na+、Ca2+外流，細胞膜內外正常的離子梯度喪失，細胞發生腫脹破裂，最終發生細胞死亡[18]。而Pannexin-1是介導該通路的必需物質。在受到LPS刺激時，Pannexin-1的裂解一方面可能通過促進ATP釋放激活P2X7受體形成非選擇性質膜孔道誘發細胞死亡；另一方面可能由于鉀離子外釋激活了NLRP3炎癥小體，引起Caspase-1的活化及IL-1β的釋放從而在細胞焦亡中發揮作用[18]。

3　細胞焦亡過程中的關鍵蛋白

3．1 GSDMD蛋白在細胞焦亡中的作用 GSDMD是一種表達于免疫細胞和小腸黏膜上皮細胞表面，由242個氨基酸組成的蛋白，是所有炎性Caspase的共同底物，是細胞焦亡的直接執行者。GSDMD被活化的炎性Caspase切割成具有成孔活性的N端(GSDMD-N)和具有結構自抑作用的C端(GSDMD-C)。GSDMD-N能特異性與細胞膜結合導致細胞膜穿孔，一方面含有細胞膜的病原體因細胞膜的破壞直接導致死亡；另一方面宿主細胞膜破裂后病原體被釋放到內環境中，被宿主的免疫系統識別殺傷。同時，GSDMD還能影響炎性細胞因子IL-1β/18的釋放，從而在細胞焦亡中發揮作用。

GSDMD是細胞焦亡過程中不可或缺的物質[19]。GSDMD蛋白是所有炎性Caspase的共同底物蛋白，細胞焦亡過程中GSDMD被炎性Caspase切割裂解成GSDMD-N和GSDMD-C，GSDMD-N具有親脂性和成孔活性，能誘導細胞焦亡，GSDMD-C具有親水性，通過與N端結合發揮自抑作用。GSDMD屬于Gasdermin蛋白家族，該家族還包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、DFNA5、DFNB59等[20]。研究人員發現幾乎所有的Gasdermin家族蛋白的N端結構域都具有誘導細胞焦亡的功能。Gasdermin N端結構域結合細胞上的脂質和在膜上打孔進而破壞細胞膜是其誘導細胞焦亡的分子基礎[21]。細胞焦亡時GADMD被切割并發生低聚化。GSDMD-N不會從細胞膜外破壞細胞的活性，而是選擇性地與質膜的內膜及細菌的膜結合，破壞細胞膜的屏障，引起細胞膜滲透性紊亂，最終導致細胞溶脹破裂。Chen等[23]從另一角度驗證了DSDMD的打孔特性。

3.2GSDME蛋白在細胞焦亡中的作用GSDME與GSDMD蛋白同屬Gasdermin蛋白家族。在TNF-α或腫瘤化療藥物的作用下，GSDME被Caspase-3切割并激活后，誘導腫瘤細胞發生細胞焦亡而非細胞凋亡。斷裂后的GSDME-N具有打孔活性，能靶向作用于細胞膜，在細胞膜上形成孔洞，從而誘發細胞焦亡。當突變切割位點D270A后，則不能發生細胞焦亡。同樣，敲除Caspase-3后，細胞焦亡現象被抑制，細胞通過Caspase-7的介導進入細胞凋亡。GSDME在化療藥物殺傷腫瘤的過程中發揮重要作用。GSDME在正常組織中均有表達[22]，在多數腫瘤細胞中，由于啟動子區的DNA甲基化，GSDME的表達被抑制，對于GSDME表達較低的細胞，DNA甲基化酶抑制劑地西他濱能顯著提高GSDME表達，將地西他濱和化療藥物(阿霉素等)聯合用藥，對腫瘤細胞的殺傷效果明顯增強。GSDME在增強化療藥物療效的同時，伴隨多種器官的損傷，說明GSDME在化療藥物的不良反應中發揮重要作用[22]。

4　細胞焦亡相關疾病

正常情況下，機體的免疫系統能識別“自己”和“非己”，在遭受病原體入侵時會啟動免疫應答以清除“異己”，保護“自己”。正常的免疫應答對機體是有益且必要的，但機體在清除病原體的同時亦會對“自體”造成損傷，這種損傷一旦過度甚至發展為不可控制時則會引發相關疾病。

4.1感染性疾病人體內Caspase-4/5是LPS的免疫受體，受到病原菌感染后，機體啟動非經典細胞焦亡途徑進行免疫應答。細胞焦亡有利于機體清除病原微生物以防御傷害，但同時大量炎性因子的募集和釋放導致炎癥反應被無限擴大，可能造成內毒素性休克等更嚴重的癥狀[14]。傷寒沙門桿菌、肺炎鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、白色念珠菌、耐藥性金黃色葡萄球菌等均能誘導細胞焦亡[23]。

4.2痛風痛風患者滑膜與關節液中IL-1β和IL-18明顯增高，與尿酸水平呈正相關，且IL-1阻斷劑治療痛風療效明顯，可能是由于尿酸結晶激活了NLRP3炎癥小體，引起IL-1β和IL-18的大量釋放促使細胞發生焦亡[24]。

4.3免疫缺陷疾病近年來發現在被SIV、HIV病毒感染后，CD4 T細胞發生了細胞焦亡，細胞焦亡引起的炎癥級聯反應將募集更多的同類免疫細胞，不受控的細胞焦亡很可能是免疫缺陷病毒對機體免疫系統造成嚴重破壞的機制之一[25]。

4.4自身免疫性疾病研究發現白癜風、Addison病、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病與 NLRP1炎癥小體介導的細胞焦亡有關，NLRP1炎癥小體通過上調IL-1β的加工在免疫損傷中扮演重要作用[26]。炎癥性腸病的發病亦與細胞焦亡密切相關。另外，動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病和肌萎縮側索硬化、肺損傷、心力衰竭、代謝綜合征和2型糖尿病等疾病的發生發展過程亦伴隨有細胞焦亡的發生。

綜上所述，細胞焦亡是機體遇到外界刺激時應答過度引發的不可控炎性損傷。GSDMD是炎性Caspase誘導細胞焦亡的直接執行者，Caspase-3激活的GSDME介導的細胞焦亡會增強化療藥物的療效，但亦與其不良反應密切相關。諸多疾病伴隨有細胞焦亡現象的發生。

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