乙型肝炎病毒對肝癌細胞中Notch信號通路的影響

劉利平，張悅，劉林森，郭躍華，張育森，鮑世韻

(暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院，深圳 518020)

腫瘤干細胞的增殖和干性維持與Notch、Wnt、Hedgehog等信號通路密切相關[1,2]。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體和細胞內效應器分子組成[3～5]。研究顯示Notch1、Notch2、Notch3、Notch4在肝癌組織中常呈過表達狀態，乙肝病毒X蛋白(HBx)可上調Notch1、Notch3、Notch4表達[6～8]。HBx是乙型肝炎病毒(HBV)編碼的蛋白產物之一。HBV是肝癌的重要致病因素之一，其對Notch信號表達的影響目前少見文獻報道。2016年5月～2017年3月，我們探討了HBV對肝癌細胞中Notch信號通路的影響。

1　 材料與方法

1.1材料收集2012～2013年暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院病理科診斷為慢性肝炎組織標本10例份，其中患者男8例、女2例，年齡(56.87±9.13)歲。10例患者乙肝表面抗原均為陽性。同時收集血管瘤瘤旁(距血管瘤2 cm)組織10例份，其中患者男7例、女3例，年齡(46.53±12.69)歲。10例患者乙肝表面抗原和丙肝抗體均為陰性。檢測標本均通過病理組織學檢查確診。鼠抗人Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hey1單克隆抗體均購自Santa Cruz 公司。胎牛血清、DMEM細胞培養液和脂質體轉染試劑Lipofectamine2000購自美國LifeTechnologies公司。PCR引物購于Invitrogen公司。肝癌HepG2.2.15細胞由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院盧銀平教授饋贈。HepG2細胞購自美國ATCC細胞庫。

1.2肝癌細胞中Notch通路相關基因表達檢測采用Real-time PCR法。將處于對數期生長階段的HepG2細胞和HepG2.2.15細胞種于6孔板中，待細胞80%融合時，收獲上述2種細胞，提取總RNA，測定RNA的濃度和純度。取0.5 μg的mRNA逆轉錄成cDNA，10倍稀釋后用于PCR檢測。Notch1引物序列：正向引物：5′-GTCAACGCCGTAGATGACC-3′，反向引物：5′-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3′；Notch2引物序列：正向引物：5′-ACTGTGAGGAGCAACTCGAT-3′，反向引物：5′-TCCACTTCATACTCACAGTTGA-3′；Notch3引物序列：正向引物：5′-TGACCGTACTGGCGAGACT-3′，反向引物：5′-CCGCTTGGCTGCATCAGCA-3′；Notch4引物序列：正向引物：5′-AACTCCTCCCCAGGAATCTG-3′，反向引物：5′-CCTCCATCCAGCAGAGGTT-3′；Hes1引物序列：正向引物：5′-ACACGACACCGGATAAACCA-3′，反向引物：5′-GCCGCGAGCTATCTTTCTTC-3′;Hey1引物序列：正向引物：5′-ATCTGCTAAGCTAGAAAAAGCC-3′，反向引物：5′-CGTCAAAGTAACCTTTCCCTCC-3′。總反應體積為10 μL：sybrGreen Mix 5 μL，cDNA模板1 μL，正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，去離子水3 μL。反應條件：95 ℃變性1 min，40次循環內95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸7 min。基因表達采用2-ΔΔCt法計算。

1.3肝癌細胞中Notch通路相關蛋白表達檢測采用Western blotting法。分別收獲HepG2細胞和HepG2.2.15細胞，通過三去污裂解液提取總蛋白，定量后經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜上。加入鼠抗人Notch1、Notch2、Notch3、Notch4單克隆抗體1∶500稀釋；鼠抗人Hes1和Hey1單克隆抗體1∶1 000稀釋；鼠抗人β-actin單克隆抗體1∶2 000稀釋。加入HRP標記的兔抗鼠二抗，1∶1 000稀釋。化學發光法曝光顯色。通過計算機掃描蛋白質條帶進行灰度分析。以β-actin作為內參照,分別用Notch1～4/β-actin、Hes1/β-actin、Hey1/β-actin值代表Notch1～4、Hes1、Hey1蛋白的相對表達量。

1.4乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中Notch通路相關蛋白表達檢測采用免疫組化S-ABC法染色，檢測Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白在乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中的表達。Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白陽性表達為細胞質或細胞核內出現淺黃、棕黃或棕褐色顆粒[8]。

2　 結果

2.1肝癌細胞中Notch通路相關基因及蛋白表達比較 HepG2.2.15細胞、HepG2細胞中Notch1基因相對表達量分別為1.31±0.04、1.00±0.01，Notch2基因相對表達量分別為1.39±0.03、0.99±0.01，Notch3基因相對表達量分別為1.23±0.02、1.00±0.01，Notch4基因相對表達量分別為1.26±0.01、1.00±0.01，下游靶基因Hes1基因相對表達量分別為2.23±0.04、0.99±0.01，Hey1基因相對表達量分別為1.95±0.07、1.00±0.01，兩種肝癌細胞中Notch通路相關基因表達比較，P均<0.05。HepG2.2.15細胞、HepG2細胞中Notch1蛋白相對表達量分別為1.71±0.12、0.99±0.07，Notch2蛋白相對表達量分別為1.68±0.09、0.97±0.05，Notch3蛋白相對表達量分別為1.57±0.08、0.96±0.04，Notch4蛋白相對表達量分別為1.53±0.09、0.96±0.07，下游靶基因Hes1蛋白相對表達量分別為3.19±0.11、0.97±0.06，Hey1蛋白相對表達量分別為2.42±0.13、0.98±0.07，兩種肝癌細胞中Notch通路相關蛋白表達比較，P均<0.05。

2.2乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中Notch通路相關蛋白表達比較Notch1、Notch2、Notch3、Notch4在肝炎組織中呈彌漫表達，陽性表達主要位于細胞質。Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白在肝炎組織中陽性表達率分別為90%、70%、90%、80%，在血管瘤瘤旁組織中的陽性表達率分別為20%、20%、10%、10%，乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中Notch通路相關蛋白表達比較，P均<0.05。

3　討論

肝癌干細胞被認為是肝癌發生、復發、轉移和耐藥的根源[6～8]。肝癌干細胞的增殖和干性維持與Notch通路的激活及表達增加密切相關。研究顯示，缺氧條件下缺氧誘導因子HIF-1α胞內聚集并進入核內，與核內的HIF-1β相結合形成有活性的轉錄因子，通過與靶基因啟動子上的CGTG結合，促進基因的轉錄[9]。Yang等[8]研究結果顯示，Notch1～4有可能是HIF-1α的下游靶基因。Gao等[10]研究報道HBx可上調Notch1和Notch4表達。本研究結果顯示，HBV可同時上調Notch1～4基因及Notch通路下游的Hes1和Hey1表達，此可能是引起肝癌細胞Notch信號通路激活的原因之一。同時我們發現，肝炎組織Notch通路亦呈激活狀態，表明Notch通路的激活先于肝癌的發生。

Notch通路激活后可誘導正常細胞致瘤性轉化，可促進細胞新陳代謝和葡萄糖攝取，可激活NF-κB和PI3K/AKT信號通路及抑制抑癌基因p53的表達，發揮抗凋亡作用。Notch信號通路激活后還可增強CDK2和CyclinD的活性，進而加快細胞周期進程[11,12]。研究[6～8]顯示，Notch1、Notch3、Notch4高表達的肝癌患者較易出現血管侵犯，術后較易復發和轉移，預后較差。阻斷Notch通路的激活可抑制肝癌細胞的生長及侵襲轉移。

已有研究顯示抗HBV治療在預防肝癌發生及抑制肝癌術后復發和轉移中能起到良好作用[13]。本研究結果顯示，HBV可激活同肝癌發生發展密切相關的Notch信號通路，此為肝炎及肝癌患者抗病毒治療提供了新的理論基礎。

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