LY294002通過PI3K/Akt/mTOR對CD133+CD44+結直腸癌干細胞自我更新、增殖能力的影響

伊紀瑛，唐晨曦，章淑芳，李孝瓊，陳政儒，李佳麗，夏金蓉，李思宇，冷政偉

(1.南充市中心醫院腫瘤科；2.川北醫學院肝膽胰腸疾病研究所，四川 南充 637000)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)發病率和死亡率在我國惡性腫瘤中排名第五；在美國已躍居第三，居消化系統腫瘤第一位；CRC患者中40%～50%在初診時已有遠處轉移，即使接受了根治性手術切除和規范放化療，最終仍然有50%以上轉移復發，腫瘤耐藥、轉移復發是CRC的主要死因[1-2]。研究證實，能夠耐受治療的細胞由腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)組成，CSCs數量十分稀少甚至無法檢測，但其強大的自我更新、增殖能力最終介導了腫瘤的轉移復發，因此，CSCs已經成為探索治療腫瘤最重要的靶點之一[3-5]?？茖W家主要通過標記CD133、CD44、CD166、EpCAM、Lgr5、ALDH、SP等標識來分析分選CRC-CSCs[6]。PI3K/Akt/mTOR通路激活后具有促進細胞增殖、抗凋亡、促進血管生成及轉移作用，已經成為腫瘤研究的熱點，但PI3K/Akt/mTOR通路在維持CRC-CSCs自我更新、增殖過程中的作用未見報道。本課題首先分選CD133+CD44+的CRC-CSCs，將PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑作用于CSCs，以研究此通路在人CRC-CSCs自我更新、增殖過程中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人結直腸癌HCT116細胞系、McCoy’s 5A培養基均購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；胎牛血清(FBS)及DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司；LY394002、牛血清白蛋白(BSA)、7-AAD、B27及胰島素購自美國Sigma公司；人表皮細胞生長因子(EGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自美國Pepro-Tech公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化工公司；PI3K/Akt/mTOR通路一抗及二抗均購自美國Santa Cruz公司；CD133-PE及CD44-FITC流式細胞術(FCM)抗體及相關試劑購自德國美天妮公司；轉錄因子流式細胞術檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 結直腸癌CD133+CD44+腫瘤干細胞分選

人結直腸癌HCT116細胞用含10% FBS的McCoy’s 5A培養基培養于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中。常規消化細胞，懸浮1×106細胞于100 μL 緩沖液中，分別加入3 μL CD133-PE及CD44-FITC抗體，4 ℃避光孵育30min，上機前7-AAD室溫孵育10min以利分選時去除死細胞，然后上機分選(BD FACSAria Fusion)，分選獲得CD133+CD44+及CD133-CD44-細胞，細胞分別培養于含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、5 μg/mL 胰島素、0.4% BSA及2% B27的無血清DMEM/F12培養基中，然后進行CD133+CD44+細胞CSCs特征鑒定，細胞培養箱中培養2 d后進行后續實驗。

1.3 細胞活性計數法檢測LY294002對CSCs增殖能力的影響

細胞活性計數法(CCK-8)：取5×103細胞/孔接種于96孔板中，實驗組用LY294002(10、20、30 μmol/L)、對照組不使用LY294002，細胞培養箱中培養3 d后加入CCK-8試劑，在450 nm波長處讀吸光度值(OD)，繪制生長曲線，抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組×100%)。

1.4 成球實驗、細胞周期檢測及平板克隆實驗

實驗流程參考本課題組發表論文[7]，成球實驗及平板克隆實驗中接種5×103細胞于相應6孔板中，2周后收集數據行統計學分析。

1.5 有限濃度稀釋法

細胞以每孔不同濃度(0.5、1、1.5、2個細胞/孔)接種于96孔板中培養2 周后記錄每孔中細胞球數量，陰性孔比例與細胞稀釋濃度作圖并進行線性回歸分析，計算CSCs比例[8]。

1.6 實時定量PCR檢測PI3K/Akt/mTOR通路基因mRNA表達

實驗步驟參考課題組發表論文[7]，引物序列如下：

GAPDH-F：5′-GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3′，

GAPDH-R：5′ GACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′；

CyclinD1-F：5′-TACCGCACAACGCACTTTC-3′，

CyclinD1-R：5′-AAGGGCTTCAATCTGTTCCTG-3′；

mTOR-F：5′-CGCTGCCCCTTTATCG-3′，

mTOR-R：5′-GGTGGAGGTGTTTGAGCAT-3′；

Bcl-2-F：5′-GTGAGAAGTGAGGGACCTTTATG-3′，

Bcl-2-R：5′-CACTCATTAGCCATATCCAACTTG-3′；

DcR3-F：5′-TTCTGCTTGGAGCACGCATCG-3′，

DcR3-R：5′-ACGCAGCTTCAGCTGCAAGG-3′。

1.7 FCM檢測PI3K/Akt/mTOR通路蛋白質表達

按照BD流式細胞術轉錄因子檢測試劑盒說明書在室溫下作用40 min以固定及通透3×105細胞，1/100稀釋的一抗在4 ℃避光作用4 h，漂洗后以1/100稀釋的熒光素標記二抗37 ℃作用30 min，不加一抗只加入二抗組設置為流式細胞術同型對照，漂洗后細胞懸浮于200 μL 孵育液中上機檢測。FCM數據采用FlowJo version 10.0分析，蛋白質相對表達量多少由熒光強度比(RFI)大小表示，RFI=樣本平均熒光強度/同型對照平均熒光強度[9-10]。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 CD133+CD44+腫瘤干細胞特征的鑒定

成球實驗是CSCs體外鑒定的一個重要方法，檢測細胞自我更新能力。成球實驗數據顯示：CD133+CD44+與CD133-CD44-細胞成球數量分別為375±16.82，11±4.58(t=36.16，P<0.01)，提示CD133+CD44+可以作為CRC-CSCs的研究模型。

2.2 LY294002對CSCs增殖能力的影響

CCK-8數據顯示，CSCs增殖能力隨LY294002濃度及作用時間增加而逐漸削弱，30 μmol/L LY294002組作用3 d后，CSCs增殖抑制率為(53.9±4.12)%，根據實驗結果取30 μmol/L組作為實驗組進行后續實驗。

與CCK-8數據相吻合，實驗組與對照組體外克隆數分別為25.67±4.16，390.67±17.01，(t=36.10，P<0.01)，以上數據顯示，LY294002對CSCs的增殖具有明顯的抑制作用。

2.3 LY294002對CSCs自我更新能力的影響

成球實驗顯示，實驗組與對照組細胞球數量分別為15.67±4.04，370±17.69，(t=33.82，P<0.01)；LDA實驗顯示，實驗組與對照組CSCs比例分別為(12.75±2.04)%，(66.02±2.47)%，(t=28.77，P<0.01)；以上數據提示實驗組CSCs自我更新能力受到明顯削弱。

2.4 LY294002對CSCs細胞周期的影響

FCM數據顯示，實驗組與對照組G0G1細胞比例分別為79.65±2.41，66.22±3.71，(t=5.26，P<0.01)；G2M比例分別為10.52±0.80，11.38±2.11，(t=0.65，P>0.05)；S期比例分別為9.83±1.66，22.46±1.65，(t=9.33，P<0.01)；數據顯示，LY294002導致了CSCs G0G1期細胞周期阻滯，從而影響細胞的分化及增殖能力。

2.5 LY294002對CSCs中PI3K/Akt/mTOR通路基因mRNA表達的影響

qRT-PCR結果顯示，實驗組誘騙受體3(DcR3)(t=15.38，P<0.01)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)(t=27.61，P<0.01)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(t=11.68，P<0.01)及細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(t=11.96，P<0.01)相對表達明顯下降。提示LY294002可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路調控CSCs惡性行為。

2.6 LY294002對CSCs中PI3K/Akt/mTOR通路基因蛋白質表達的影響

為了進一步驗證及明確LY294002通過PI3K/Akt/mTOR通路調控CSCs的具體機制，通過FCM檢測該通路基因蛋白質表達及磷酸化Akt(p-Akt)表達變化。數據顯示，實驗組中DcR3(t=11.53，P<0.01)、Bcl-2(t=13.54，P<0.01)、mTOR(t=10.66，P<0.01)及Cyclin D1(t=9.21，P<0.01)蛋白表達量明顯下降。Akt磷酸化蛋白表達下降(t=7.10，P<0.01)，提示LY294002可能通過抑制磷酸化Akt進而抑制PI3K/Akt/mTOR通路，削弱CSCs的惡性行為。

3 討論

CSCs是存在于腫瘤中極小群(甚至無法檢測)具有強大自我更新及成瘤能力的細胞，CSCs具有干細胞特征，對傳統放化療不敏感，最終介導了腫瘤的耐藥、轉移復發[11]。探索CSCs維持自我更新、增殖能力的內在機制以靶向殺傷CSCs，已經成為腫瘤研究的難點和熱點[12]。但CSCs比例極少，獲取足夠的細胞并保證細胞模型的正確性就顯得尤為重要。目前獲取CSCs的方法主要包括：無血清懸浮培養法，免疫磁珠分選法(MACS)及流式細胞術分選(FACS)法，前兩種方法操作簡單、成本低，但獲得CSCs純度較低。FACS獲得的細胞純度高可以作為CSCs理想的研究模型，但其技術難度高、操作復雜，應用并不廣泛[13-14]。本課題組結合前期研究基礎，FACS獲得CD133+CD44+及CD133-CD44-細胞群，并通過成球實驗檢測其自我更新能力，證明CD133+CD44+具有CSCs特征，而CD133-CD44-細胞不具有。Zhou等[6]研究也證明HCT116細胞中的CD133+CD44+細胞具有強大的自我更新、增殖及侵襲轉移能力，具有CSCs特征。以上數據顯示CD133+CD44+細胞可以作為CRC-CSCs研究理想的細胞模型，并用于本研究，并進一步研究PI3K/Akt/mTOR通路在維持CSCs惡性行為中的作用。

PI3K/Akt/mTOR通路被報道在包括CRC在內的多種腫瘤中異常激活，參與腫瘤血管生成、增殖、抗凋亡及侵襲轉移過程，此通路的激活與腫瘤低分化、高浸潤度及淋巴轉移正相關[15]。PI3K磷酸化PIP2形成PIP3，繼而磷酸化激活下游Akt等促進細胞惡性行為。激活的Akt能夠上調Cyclin D1、c-myc等促進增殖；同時激活的Akt上調mTOR促進細胞生長；上調VEGF促進血管生成；另外，激活的Akt通過激活Bcl-2發揮抗凋亡效應[16]。目前PI3K/Akt/mTOR通路在普通腫瘤細胞或腫瘤群體細胞中研究較多，但在決定腫瘤進展的關鍵—CSCs中研究未見報道。本課題組前期研究已經證實CSCs與非CSCs在基因表達及功能、生物學行為方面存在巨大差異，CSCs數量極少甚至無法檢測，基因在CSCs中的功能可能會被大量的非CSCs所掩蓋和干擾，治療策略無法靶向殺滅CSCs，最終導致CSCs存活及由此介導的腫瘤耐藥、轉移復發[7]。所以，研究并靶向作用CSCs維持惡性行為的分子機制可能是腫瘤治療的關鍵[12]。因此本課題在前期研究基礎上，在純化的CRC-SCs中研究此通路對腫瘤惡性行為的影響及機制。

LY294002是強力的PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑，通過非特異性阻斷通路導致Akt磷酸化水平下降，進一步抑制下游基因Cyclin D1、mTOR、Bcl-2、DcR3、VEGF等表達，導致細胞凋亡增加、增殖及侵襲遷移能力下降[17]。本研究發現，LY294002作用CSCs后，PI3K/Akt/mTOR通路被抑制，Akt磷酸化水平降低并導致下游靶基因的mRNA和蛋白質表達下降，CSCs的自我更新能力、增殖能力明顯削弱，出現G0G1期周期阻滯。傳統的蛋白質檢測多采用Western-blot技術，但是其檢測周期長、所需樣本量較大、對磷酸化蛋白檢測準確性不高，用于檢測極少量的CSCs中蛋白質的表達非常困難。本研究采用FCM檢測蛋白質，具有操作時間短、所需樣本少、對磷酸化蛋白檢測更加準確的優勢，非常有利于檢測CSCs中磷酸化蛋白的表達[9-10]。

本研究首次發現LY294002可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路削弱CSCs的自我更新能力，這一作用未見其他研究團隊報道。自我更新是指CSCs通過對稱或者不對稱分裂產生新的CSCs及各種腫瘤細胞，自我更新能夠維持CSCs多分化潛能，是腫瘤存活、治療抵抗、轉移復發的關鍵，深入研究CSCs自我更新機制，對于開發靶向殺傷CSCs的藥物及治療策略具有重要意義。但本研究提示的LY294002可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路調控CSCs自我更新能力的機制需要進一步研究。以上研究提示，LY294002可以阻斷PI3K/Akt/mTOR通路激活進而抑制CRC-CSCs自我更新、增殖，表明阻斷該通路可能有效抑制CSCs惡性行為，為靶向殺滅CSCs提供新的靶點。

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