不同方式提取的生姜粗、精多糖體外抗氧化研究

王蕓，位思清，王雪，宋榮珍，唐曉珍*

(1.山東農業大學，山東 泰安 271018；2.山東省外貿職業學院，山東 泰安 271000)

自由基是機體內不可或缺的重要活性物質，參與多種生命過程[1]。但是過多的自由基可以造成生物膜系統損傷以及細胞內氧化磷酸化障礙[2,3]，引起慢性疾病及衰老效應[4]，是人體疾病、衰老和死亡的直接參與者，對人體健康和壽命危害非常大。因此，尋找強有效的自由基清除劑已成為當今十分活躍的研究領域[5-7]。

近年來，人們對多糖的抗氧化活性作用有了更深的認識，已有大量研究表明：多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質過抗氧化作用、抑制亞油酸氧化等抗氧作用[8-10]。生姜多糖是生姜中的有效活性成分，具有很強的藥理作用，如抗疲勞、保護腦缺血再灌注損傷等[11，12]。部分研究發現與精多糖相比，粗多糖具有更高的活性[13]。因此，本文就不同方式提取所得的生姜粗、精多糖進行抗氧化的研究，為生姜資源的開發和尋找有效的抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

生姜：山東大唐生物科技有限公司；纖維素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、S-8大孔樹脂：北京索萊寶科技有限公司；果膠酶：上海通善生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、磷酸氫二鈉、檸檬酸、葡萄糖、硫酸：天津市凱通化學試劑有限公司；蒽酮：國藥集團化學試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

FA2004 電子分析天平 上海上平儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；201A-1恒溫干燥箱 山東省龍口市電爐制造廠；RE52CS 旋轉蒸發儀、B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵、BT600-2J 蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司；1.6 cm×50 cm層析柱、HL-2S 恒流泵、SBS-100 數控計滴自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生姜多糖的不同方式提取

1.3.1.1 脫脂

鮮姜洗凈、去皮、切絲后，于55 ℃的烘箱中烘干12 h，索氏提取2次后[14]，揮干溶媒，得脫脂脫色姜粉。

1.3.1.2 酶法提取

將脫脂脫色的姜粉中加入1.5%纖維素酶、1%果膠酶、2%木瓜蛋白酶、2.5% α-淀粉酶，按料液比1∶20 (g/mL)添加pH為5.2磷酸-檸檬酸緩沖液，55 ℃水浴中浸提1 h。浸提結束后4500 r離心15 min。取上清液進行抽濾，將抽濾液中加入3倍95%乙醇醇沉12 h，醇沉結束后取沉淀離心4500 r離心15 min。將沉淀復溶得生姜粗多糖溶液。水法提取[15]：將脫脂脫色后的姜粉按料液比1∶20(m/V)添加蒸餾水，90 ℃水浴3 h。后續操作同酶法提取。

1.3.1.3 超聲波輔助酶法提取[16]

將脫脂脫色的姜粉中加入1.5%纖維素酶、1%果膠酶、2%木瓜蛋白酶、2.5% α-淀粉酶，按料液比1∶20 (g/mL)添加pH為5.2的磷酸-檸檬酸緩沖液，55 ℃，400 W的條件下超聲20 min，之后水浴40 min。后續操作同酶法提取。

1.3.2 脫蛋白色素

將上述溶液配制成50 mg/mL的生姜粗多糖溶液分別進行大孔樹脂純化。根據實驗室前期實驗結果，選擇純化條件為：上樣量70 mL；上樣濃度 50 mg/mL；上樣流速1.5 mL/min；用水洗脫，洗脫流速1.5 mL/min；洗脫體積2.5 BV。

1.3.3 透析

將脫蛋白后的生姜多糖溶液裝入孔徑為3500 kDa的透析袋中透析12 h，每隔4 h換1次水。

1.4 多糖含量測定

采用蒽酮比色法進行測定。準確吸取樣液1 mL加入具塞試管中，再加入5 mL蒽酮試劑，搖勻后立即放于沸水中水浴6 min。水浴結束后立即冷卻至室溫。以空白試劑為參比，于620 nm處測其吸光度[17]。

以葡萄糖濃度對吸光度y進行線性回歸，線性回歸方程為y=5.197x，相關系數R2=0.999，線性相關性良好。

1.5 多糖得率及純度計算

將上述多糖溶液冷凍干燥得固體樣品，稱重計算其得率和純度。

多糖得率[18]=粗多糖質量/姜粉質量×100%；

粗(精)多糖純度=粗(精)多糖樣品中多糖含量/粗(精)多糖樣品質量×100%。

1.6 純度鑒定

將純化前、后的多糖溶液，用紫外可見分光光度計進行掃描。

1.7 抗氧化性測定[19]

1.7.1 DPPH自由基清除率的測定

分別取不同濃度的各樣品溶液2.0 mL，置于10 mL離心管中，加入3.0 mL的DPPH自由基溶液，然后室溫避光反應30 min。以蒸餾水為空白，于517 nm波長處測定吸光值。按下列公式計算DPPH自由基清除率，實驗重復 3 次。

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(As-Ac)]/A0×100%。

1.7.2 清除羥自由基活性的測定

分別取不同濃度生姜多糖溶液1.0 mL置于10 mL試管中，分別加入水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，加蒸餾水至 5.0 mL，再分別加入H2O21.0 mL，于37 ℃水浴中反應10 min。以蒸餾水為空白，于510 nm 波長處測定吸光度。按照下列公式計算羥自由基清除率，實驗重復3次。

羥自由基清除率 (%)=[A0-(As-Ac)]/A0×100%。

1.7.3 還原力的測定

分別取不同濃度的各樣品溶液2.0 mL，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液和2.5 mL鐵氰化鉀溶液，將所得的混合物于50 ℃水浴保溫20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸溶液，混合溶液4000 r/min離心10 min，精密吸取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵溶液，以蒸餾水為空白，在700 nm處測吸光度，實驗重復3次。

1.8 數據處理

采用Origin 8.5作圖，用SPSS 16.0軟件對結果進行數據分析，各組數據結果均以平均值±SD(n=3)表示，并進行方差分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同方式提取的生姜多糖主要化學組分的比較

表1 不同方式提取的生姜多糖得率和純度的比較Table 1 The yield and purity of ginger polysaccharides by different extraction ways

由表1可知，酶法提取的生姜粗多糖的得率和純度均明顯高于水法，但與超聲輔助酶法相比差異性不顯著(P<0.05)。超聲輔助酶法提取的生姜粗多糖的得率略高于酶法提取，這可能是由于果膠酶、纖維素酶和α-淀粉酶等酶類對植物細胞進行破壁提取[20,21]，而后超聲波的機械破碎和空化作用促使了多糖和其他物質從原料向溶劑的擴散速率[22,23]，從而進一步提高了其提取率。純化后的生姜精多糖基本不含蛋白質、單糖、色素等物質[24]。3種精多糖其純度均超過90%，差異性不顯著(P<0.05)。超聲輔助酶法提取生姜粗多糖純化后的純度略低于酶法和水法，這是由于超聲波輔助提取雖然可以提高多糖的提取得率，但會造成粗多糖的組分更加復雜，分離稍加困難[25]。

2.2 不同提取方式對生姜粗、精多糖抗氧化性的影響

2.2.1 對DPPH自由基清除率的影響

圖1 不同提取方式對生姜粗多糖DPPH自由基清除率的影響Fig.1 The effect of crude polysaccharides on DPPH radical scavenging activity by different extraction ways

DPPH自由基清除率是一種常用評價新抗氧化劑自由基清除率的方法[26,27]。由圖1可知，對于3種不同方式提取的生姜粗多糖，其DPPH自由基清除率均先隨生姜粗多糖濃度的增大而增大，當濃度達到0.8 mg/mL后出現下降趨勢，三者之間均差異性不顯著(P<0.05)。其清除率下降原因可能與生姜粗多糖的空間結構有關，當多糖溶液達到一定的濃度時，其有效基團被包裹在內無法外露產生作用[28]。結果表明不同方式提取的生姜粗多糖對DPPH自由基的清除能力效果顯著，超聲輔助酶法、酶法和水法對DPPH自由基最高清除率依次為77.0%，75.4%和65.8%。

圖2 不同提取方式對生姜精多糖DPPH自由基清除率的影響Fig.2 The effect of pure polysaccharides on DPPH radical scavenging activity by different extraction ways

由圖2可知，在濃度為0～1 mg/mL的范圍內，純化后的3種生姜精多糖其DPPH自由基清除率均隨濃度的增加而增大，并具有一定的線性關系。與粗多糖相比，3種精多糖對DPPH自由基的清除能力較低，但在濃度為1 mg/mL時其對DPPH自由基清除能力基本等于粗多糖，超聲輔助酶法、酶法和水法對DPPH自由基的清除率依次為45.1%，44.1%和37.6%。此外，3種精多糖對DPPH自由基的清除能力差異性不顯著(P<0.05)，說明純化后的多糖組分基本相同。上述說明粗多糖中對DPPH自由基發揮清除作用的成分是多糖。

2.2.2 對羥基自由基清除率的影響

圖3 不同提取方式對生姜粗多糖羥基自由基清除率的影響Fig.3 The effect of crude polysaccharides on hydroxy radical scavenging activity by different extraction ways

羥基自由基具有極高的反應性能并可以損害細胞，但它可以被抗氧化劑抑制[29]。由圖3可知，對于不同方式提取的生姜粗多糖，都具有很高的羥自由基清除效果，清除效果差異性不顯著(P<0.05)，濃度在1 mg/mL時清除率分別高達99.7%，99.1%，93.1%。3種粗多糖對羥自由基的清除率隨濃度增大而增大，當濃度高于0.2 mg/mL后三者都緩慢增大，差異性顯著(P<0.05)。結果表明不同方式提取生姜粗多糖對羥基自由基的清除能力效果顯著。

圖4 不同提取方式對生姜精多糖羥基自由基清除率的影響Fig.4 The effect of pure polysaccharides on hydroxy radical scavenging activity by different extraction ways

由圖4可知，與粗多糖相比，3種生姜精多糖對羥基自由基清除效果差異性不顯著(P<0.05)，在濃度為1 mg/mL時清除率僅為4.0%左右，這說明在實驗條件下，生姜精多糖不與羥基自由基反應，對實驗中所存的影響體系不大，故在510 nm波長處吸收不明顯。結果表明生姜精多糖無清除羥基自由基的效果，粗多糖對羥基自由基的極其顯著清除效果不是精多糖的作用。

2.2.3 對還原力的影響

天然化合物還原能力可以作為評價羥自由基清除能力的一項重要指標，還原能力越強，其羥自由基清除能力越強[30]。

圖5 不同提取方式對生姜粗多糖還原力的影響Fig.5 The effect of crude polysaccharides on reducing power by different extraction ways

由圖5可知，對于不同提取方式的生姜多糖其還原能力隨生姜多糖濃度的增大而增大，并具有一定的線性關系，其中超聲輔助酶法>酶法>水法。這表明不同方式提取的生姜多糖還原能力效果顯著，其中超聲輔助酶法提取的還原能力最強，在濃度為1 mg/mL時吸光度為1.38。

圖6 不同提取方式對生姜精多糖還原力的影響Fig.6 The effect of pure polysaccharides on reducing power by different extraction ways

由圖6可知，在還原力測定實驗中，與粗多糖相比，3種生姜精多糖的還原能力不顯著，在濃度為1 mg/mL時其吸光度僅為0.15左右，說明生姜精多糖不與反應體系中的物質反應，在700 nm波長處沒有吸收。

3 討論

在DPPH自由基清除實驗中，生姜粗、精多糖均具顯著的抗氧化性，說明粗多糖中的多糖發揮了清除DPPH自由基的作用。由于粗多糖中含有少量姜酚和姜黃酮等物質，而姜酚和姜黃酮具有高的清除自由基的能力[31,32]，所以開始時羥基自由基清除生姜粗多糖的DPPH自由基清除能力高于精多糖。但當生姜粗多糖溶液達到一定濃度后，其清除DPPH自由基的有效基團被包埋在內，無法外露產生作用，所以會出現下降現象。在羥基自由基清除實驗和還原力實驗中，生姜粗多糖表現出很強的抗氧化性，而生姜精多糖的抗氧化性不顯著，說明粗多糖中發揮清除羥基自由基和還原能力的可能是除多糖外的其他成分，也可能是多糖與其他成分協同作用的結果[33]，但具體機理有待進一步研究。與生姜粗多糖相比，精多糖的制備時間相對較長，制備工藝也相對復雜，這也對其抗氧化能力造成了一定的影響。另外，酶法提取的生姜多糖其得率、純度高，抗氧化性能高，從能源角度和工業成本可以考慮其為較佳的提取方式。

4 結論

經超聲輔助酶法、酶法和水法3種方式提取生姜粗多糖和純化后生姜精多糖。結果表明3種不同方式提取的生姜粗多糖對DPPH自由基、羥基自由基的清除能力強，差異性不顯著(P<0.05)；還原能力與粗多糖的濃度具有線性關系，其中超聲輔助酶法>酶法>水法，差異性顯著(P<0.05)；而生姜精多糖只對DPPH自由基有顯著影響，對羥基自由基清除效果和還原能力不顯著。

[1]Valko M,Leibfritz D,Moncol J,et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2007,39(1):44-84.

[2]趙虹，駱慶和，殷明，等.氧化應激與阿爾茨海默病[J].中國老年學，2013，33(16):4090-4093.

[3]張翠利,付麗娜,楊小云,等.活性氧自由基與細胞衰老關系的研究進展[J].廣州化工,2015(19):5-7.

[4]趙保路.自由基、營養、天然抗氧化劑與衰老[J].生物物理學報,2010(1):26-36.

[5]賈天華,崔紅.核桃楸皮的抗衰老自由基機制研究[J].中國藥物經濟學,2013(3):212-213.

[6]農石生,龔子龍,周金花,等.板藍根抗氧化成分及抗氧化性能研究[J].中國野生植物資源,2017(3):18-22.

[7]鐘靈,王振富,文德鑒.黃芪多糖抗衰老作用的實驗研究[J].中國應用生理學雜志,2013(4):350-352.

[8]陳玉琴,南海娟,劉坤峰.蕨菜多糖提取及抗氧化特性[J].北方園藝,2014(14):128-132.

[9]包瑛,馬岳,李雅雙,等.大白樁菇多糖的結構鑒定及清除自由基活性[J].食品科學,2016(6):71-76.

[10]段晉寧,肖旺,曾建紅,等.莪術多糖對糖尿病大鼠血糖、抗脂質過氧化作用的影響與單糖組分分析[J].時珍國醫國藥,2016(3):569-572.

[11]夏樹林,吳慶松.生姜多糖的提取及其抗疲勞作用[J].江蘇農業科學,2014(4):240-242.

[12]宋琳琳,沙靖全,張磊,等.生姜粗多糖的提取及對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用[J].遼寧中醫雜志,2015(12):2433-2435.

[13]劉杭達,馬千蘇,王傑,等.紫山藥粗多糖提取工藝的優化及其抗氧化性的研究[J].食品工業科技,2015(23):208-213.

[14]馬利華,秦衛東,賀菊萍,等.復合酶法提取生姜多糖[J].食品科學,2008(8):369-371.

[15]鄧勝國,尹愛武,陳鐵壁.生姜多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].湖南科技學院學報,2013(4):66-70，73.

[16]刁文超,王然,王鳳舞,等.超聲波協同復合酶法提取南瓜多糖工藝優化[J].食品科學,2012(18):14-20.

[17]王憲澤,王保莉,馮炘.生物化學實驗技術原理和方法[M].北京：中國農業出版社,2002:75-77.

[18]馮鑫,夏宇,陳貴堂,等.生姜皮多糖的分離純化及其結構組成分析[J].食品科學,2017(6):185-190.

[19]許海順,蔣劍平,徐攀,等.紅參多糖抗氧化活性的研究[J].浙江中醫藥大學學報,2011(6):909-912.

[20]滕利榮,孟慶繁,劉培源.酶法提取百合多糖及其體外抗氧化活性[J].吉林大學學報(理學版),2003,41(4):538-542.

[21]陳石良,孫震,谷文英.灰樹花深層發酵菌絲體多糖的酶法提取及其抗腫瘤作用[J].無錫輕工大學學報,2000，19(4):336-339.

[22]Zhang Y,Wang Z Y,Chen X Q.Ultrasound associated extraction of seed oil of Korean pine[J].Journal of Forestry Research,2005,16(2):140-142.

[23]趙玉紅,王靜,金秀明.超聲波輔助酶法提取榛子殼色素工藝條件的研究[J].中國調味品,2010,35(4):110-114.

[24]巴特.大棗多糖提取純化工藝研究進展[J].農業科技與裝備,2015(11):52-54.

[25]鄭德勇,安鑫南.植物抗氧化劑的研究概況與發展趨勢[J].林產化學業,2004(3):113-118.

[26]Bondet V,Brand W,Berset C.Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method [J].Food Science and Technology,1997,30:609-615.

[27]Khaskheli S G,Zheng W,Sheikh S A,et al.Characterization ofAuriculariaauriculapolysaccharides and its antioxidant properties in fresh and pickled product[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,81:387-395.

[28]王金璽,顧林,孔凡偉,等.雞腿菇粗多糖的體外抗氧化性[J].食品科學,2012(13):79-82.

[29]Rollet-Labelle E,Grange M J,Elbim C,et al.Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator of polymorphonuclear neutrophil apoptosis[J].Free Radical Biology & Medicine,1998,24:563-572.

[30]Shimada K,Fujikawa K,Yahara K,et al.Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J].Agric.Food Chem.,1992,40:945-948.

[31]馬建蘋.生姜中七個新的六氫姜黃素類化合物的NMR研究[A].中國物理學會波譜專業委員會.第十三屆全國波譜學學術會議論文摘要集[C].中國物理學會波譜專業委員會,2004:2.

[32]莫開菊,柳圣,程超.生姜黃酮的抗氧化活性研究[J].食品科學,2006(9):110-115.

[33]娜日蘇.天然植物多糖及復合多糖的研究進展[J].赤峰學院學報(自然科學版),2009(1):68-72.