2種人工誘導玉米孤雌生殖育種方法的比較

張廣峰，盧保紅，孟麗霞，魏榮業(yè)，杜如珊，程 宏

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院玉米研究所，山西 忻州 034000；2.五臺縣氣象局，山西 五臺 035500）

優(yōu)良玉米自交系的選育是玉米雜交育種的基礎和關鍵，在常規(guī)選育玉米自交系過程中，要得到一個比較穩(wěn)定的純系需要7～8代，耗時長，人力、物力投入多，且不能達到完全純合，而玉米孤雌生殖育種方法以其能快速、穩(wěn)定地獲得完全純合自交系的優(yōu)勢，無可爭議地成為各國玉米育種的重要手段。現(xiàn)階段，誘導玉米孤雌生殖的方法主要有化學藥劑和誘導系雜交2種。本研究分別從二者的機理、過程、影響因素等方面進行綜述，分析了其在實際應用中各自的優(yōu)劣點及適用條件，以期為玉米孤雌生殖育種實踐提供指導。

1 化學方法誘導玉米孤雌生殖

1.1 化學方法誘導玉米孤雌生殖的相關機理

關于化學藥劑誘導玉米進行孤雌生殖得到種子的來源和過程，至今還沒有統(tǒng)一的、明確的觀點能夠闡釋。其中，關于二倍體胚的來源，業(yè)內(nèi)目前主要有2種推論：一是單倍體的卵細胞經(jīng)過自然加倍、核內(nèi)復制形成二倍體胚（如卵細胞單獨開始分裂就會形成單倍體胚，最后成為單倍體種子，單倍體與二倍體植株可由其形狀區(qū)分）[1]，二是未進行減數(shù)分裂的卵細胞[2-3]。對于二倍體胚乳的來源同樣有2種推測：一是類似其他植物的無融合生殖即極核沒有經(jīng)過受精而直接發(fā)育形成胚乳[4-6]，二是由珠心細胞經(jīng)過一系列發(fā)育而成胚乳。

1.2 化學方法誘導玉米孤雌生殖的影響因素

1.2.1 不同處理方法和時期 化學藥劑誘導玉米孤雌生殖的方法主要有：（1）噴施法。即在雌穗吐絲前，選取健壯、無病蟲害的植株雌穗進行人工套袋，并去除套袋株及附近植株的雄穗。在花絲長約2～4 cm時，于早晨未散粉前取下套袋，將藥液均勻噴灑在花絲上，之后再次套袋并固定在果穗上[7]。（2）注射法。即在雌穗吐絲前，選取健壯、無病蟲害的植株雌穗進行人工套袋，在果穗長8～10 cm時，取下套袋，剪去頂部3～5 cm的苞葉，將裝有藥液的注射器針頭從可見花絲處中央微微插入并注入1～2滴藥液后再次套袋，同時固定在果穗上[8]。在實際操作中噴施法與注射法各有優(yōu)劣[9]：噴施法在結實率方面表現(xiàn)更好，且操作簡單，缺點是雜株率較高，如具備隔離條件，使用噴施法效果較好；使用注射法時基本沒有雜株，但結實率比噴施法要低，不具備隔離條件時，應使用注射法并適當增加注射次數(shù)（2～3次）[10]。

1.2.2 不同基因型及基因純合度的影響 很多研究表明，化學藥物誘導不同基因型玉米材料進行孤雌生殖的頻率差異顯著[11-13]。于運凱[10]研究表明，誘導不同基因型玉米材料進行孤雌生殖的頻率大小順序為蘭卡群＞黃早群＞瑞德群，并且相對于其他影響因素而言，基因型的影響效果是最大的。研究還發(fā)現(xiàn)，藥物誘導自交系的孤雌生殖頻率比較低，而雜交種相對較高，說明基因的純合度或雜合性與孤雌生殖誘導有關，其誘導效果大小順序為：群體＞雜交組合＞育種中間材料＞自交系[14]。

1.2.3 藥劑及其濃度 國內(nèi)外研究人員經(jīng)過多年的試驗研究，結果表明，多種藥物能夠誘導玉米進行孤雌生殖，其中，誘導頻率較高、結實好的藥劑主要有秋水仙堿（COL）、二甲基亞砜（DMSO）、馬來酰胼（MH）等。HU等[15]通過試驗得出，誘導效果最好的藥劑及其濃度組合為0.01%DMSO和0.01%DMSO＋0.01%甲烷磺酸。而石太淵等[16]的研究認為，2%DMSO＋40 mg/kgMH＋0.1%COL的誘導效果最好。目前，對于誘導劑及最佳濃度的問題還沒有統(tǒng)一的定論，有待進一步研究。

1.3 化學藥劑誘導玉米孤雌生殖育種技術的優(yōu)勢與應用

1.3.1 縮短育種時間 藥物誘導玉米孤雌生殖在當代就可獲得純合二倍體，再經(jīng)擴繁、鑒定，2～3 a即可形成純系并進入育種階段，較之常規(guī)選育自交系極大地縮短了時間。

1.3.2 精確選擇目標性狀 孤雌生殖個體的選擇本質上是單倍體的選擇，因此，極大地提高了目的性狀選擇概率[17]，從而使得早期測配更加準確。

1.3.3 選擇范圍廣 與其他育種方法相比，藥物誘導孤雌生殖對于不同基因型甚至高度雜合的、發(fā)生瘋狂分離的遠緣雜種均有效果[18]，使得物種間的基因交流更加容易，進而達到創(chuàng)制新種質的目的。

1.3.4 操作簡便 該技術操作簡單，一般人員稍加培訓均可掌握。

1.3.5 固定雜種優(yōu)勢 孤雌生殖產(chǎn)生二倍體是一種固定雜種優(yōu)勢的有效途徑。

1.4 化學藥劑誘導玉米孤雌生殖育種技術中存在的問題

1.4.1 最佳誘導劑和濃度未有定論 雖然已有眾多研究人員對誘導劑和濃度進行了試驗并得到了一些數(shù)據(jù)，但結果并不一致，加之誘導率普遍偏低，導致該技術沒有能夠被廣泛應用。因此，最佳誘導劑和濃度問題仍需進一步研究。

1.4.2 誘導結果差異明顯 通過化學誘導獲得的后代，并不全都理想，除了有明顯的分離現(xiàn)象外[11，19]，還含有非整倍體、雜合體等個體，表現(xiàn)并不完全穩(wěn)定[7，14]。

1.4.3 鑒定方法不完善 目前對孤雌生殖體的鑒定[20-21]，還沒有統(tǒng)一、權威、準確的方法。

2 誘導系雜交誘導玉米孤雌生殖技術

2.1 誘導系誘導玉米孤雌生殖產(chǎn)生單倍體的相關機理

孤雌生殖誘導系是指可以作為父本雜交誘導母本得到遠高于自然頻率單倍體的純合系。1941年COE[22]將1份具有紅色葉耳、白色胚乳、紫色糊粉層、硬粒型特殊性狀的晚熟玉米材料用作色素研究，并在1950年將此材料命名為Stock6，將其作為父本對其他系雜交時可以產(chǎn)生1%～2%的單倍體。Stock6誘導產(chǎn)生單倍體的原理是雙受精過程中一個精核與2個極核結合形成正常胚乳，而另一個精核不能與卵細胞結合形成受精卵，從而發(fā)育成單倍體胚[23]。

2.2 誘導系的發(fā)展

除Stock6外，國外研究人員還相繼改良培育出了A358，ZMS，MKS，MHI等單倍體誘導材料，都可以產(chǎn)生3%以上的單倍體胚。

我國研究人員也對Stock6進行了改良、選育。中國農(nóng)業(yè)大學的劉志增等[24]利用BHO（高油群體）與Stock6雜交，經(jīng)多代雜交選育出農(nóng)大高誘1號，其誘導率達5%～6%；吉林省農(nóng)業(yè)科學院的才卓等[25]育成的吉高誘3號，平均誘導率可達10%以上。

2.3 誘導系雜交誘導的過程

2.3.1 基礎群體的組建 基礎群體是準備作為母本與誘導系雜交的基礎材料，其將直接決定最終所產(chǎn)生DH系的各種性狀，因此，組建基礎群體是關系到孤雌生殖單倍體育種成功的決定性環(huán)節(jié)。

2.3.2 母本世代的選擇 低代材料具有吐絲期集中、果穗較大、基因豐富、便于誘導的優(yōu)點，因此，誘導系誘導雜交的母本大多選擇低代材料。

2.3.3 雜交誘導 雜交誘導有人工誘導和自然誘導2種方式，其中，人工誘導就是以誘導系為父本，以組建的目標群體為母本進行的雜交，小規(guī)模、無隔離條件時選擇人工誘導；自然誘導類似于大田制種，要具備隔離條件，父、母本的比例為1∶3或2∶4左右，種植前一定要測算好父、母本的花期以確定各自播期，面積較大時選擇自然誘導。人工誘導相比自然誘導的缺點是結實不好、費工、費時、易混雜，如條件許可，應選擇自然誘導的方式。

2.3.4 單倍體的鑒定與挑選 單倍體的鑒定方法主要有：細胞遺傳學方法、形態(tài)學和解剖學方法、放射性法、分子標記法、遺傳標記法。實際操作時可根據(jù)自身情況選擇一種或幾種方法實施。

2.3.5 單倍體的加倍

2.3.5.1 自然加倍 自然加倍就是將單倍體種子不經(jīng)處理直接播于田間，在自然條件下生長、授粉、收獲。其加倍率低，僅為1%～5%，在土地、水肥等環(huán)境條件較好時，加倍率可以得到顯著提高。

2.3.5.2 人工加倍 不能進行自然加倍的一些單倍體材料，可以采用人工加倍的方法進行。人工加倍就是利用一些化學的、物理的方法處理單倍體材料，以達到單倍體加倍的方法。目前利用較多的是以秋水仙素和除草劑等化學藥物處理的化學加倍，效果較好的化學加倍方法主要有浸種法、注射法、浸芽法等。

2.3.6 雙單倍體系的評價 玉米單倍體加倍后所得籽粒一般不多，因此，需對其進行擴繁，之后依據(jù)DH系植株、穗部、籽粒等性狀指標進行鑒定、評價，初步選擇符合自身育種目標的DH系進行下一步的測交與產(chǎn)量測試，并再次進行鑒定、淘汰，最后選出符合育種目標的DH系。

2.4 誘導系雜交誘導玉米孤雌生殖技術的優(yōu)勢與應用

2.4.1 快速選育純合系及提純親本 孤雌生殖誘導系誘導玉米單倍體育種方法一般只需2代即可得到純合的重組二倍體，且這種二倍體理論上是100%的純合。在玉米種子生產(chǎn)過程中，親本經(jīng)過多年繁育后會有退化和混雜的現(xiàn)象，其將直接影響到雜交種的純度和原本性狀，利用單倍體技術可對其進行提純和保持優(yōu)良特性。

2.4.2 群體改良 采用常規(guī)育種法改良玉米群體周期長、效率低。而單倍體育種技術不僅可以提高改良的效率，還可以簡化基因互作、消除超顯性效應、淘汰不良隱性基因的影響，從而加大選擇的目的性，因此是群體改良的重要補充方法。

2.4.3 遺傳學研究 雙單倍體群體還可用于一些遺傳簡單的基因定位及克隆，構建遺傳圖譜，在遺傳學上有重要的研究價值。

2.5 誘導系誘導玉米孤雌生殖的影響因素

2.5.1 不同母本基因型對單倍體誘導率的影響有研究表明，同一誘導系雜交誘導不同基因型母本間的單倍體誘導率差異較大，但不同遺傳背景或雜種優(yōu)勢類群材料與單倍體誘導率之間的關系仍不明確[26]。

2.5.2 不同環(huán)境對單倍體誘導率的影響 不同環(huán)境對誘導單倍體的結果影響較大：環(huán)境較差的誘導率僅2.0%，而環(huán)境理想的誘導率可達16.4%[27]。在海南冬季的單倍體誘導率明顯高于我國北方地區(qū)[25]。

2.5.3 不同花絲長度對單倍體誘導率的影響 有研究表明，長花絲（7 cm以上）的平均誘導率明顯大于短花絲（4 cm以下）的平均誘導率[28]。

2.5.4 不同授粉時期對單倍體誘導效率的影響有研究表明，伏后授粉平均誘導率明顯大于伏期授粉的平均誘導率[28]。

2.6 誘導系雜交誘導玉米孤雌生殖育種技術中存在的問題

2.6.1 缺乏優(yōu)良誘導系 當前，配合力強、標記明顯且誘導率高的誘導系仍然缺少，選育優(yōu)良誘導系是誘導玉米單倍體育種技術的重點研究方向[24-25]。

2.6.2 難以組建足夠數(shù)量的基礎材料 基礎材料的選擇是單倍體育種工作成效的決定要素，因其與單倍體的誘導率及加倍率均顯著相關，并直接決定雙單倍體的各種性狀。

2.6.3 誘導率和加倍率偏低 目前，雖然單倍體的誘導率及加倍率均有所提高，但由于技術本身的特殊性，受到多種因素影響，二者效率仍然低下，提高誘導率和加倍率仍是單倍體技術的重點、難點。

2.6.4 加倍材料的管理工作量大 單倍體植株生長健壯對育性的恢復非常重要。由于其生長的特殊性，對環(huán)境要求較高，因此，一定要保證其生長所需的土、肥、水、熱等條件；田間除草、去雜要貫穿整個生育期；單倍體一般為雄性不育與雌雄不協(xié)調(diào)，因此，單倍體授粉需仔細觀察、多次精細授粉，才能保證結實，其授粉過程比正常植株要復雜、困難較多。

3 結論與討論

孤雌生殖育種技術在玉米育種中的應用前景十分廣闊。其可以快速有效地累積目標材料中有利的雙親互補基因，達到群體材料遺傳重組與改良的目的；還可以聚合足夠多的有利基因位點，利用單倍體技術使優(yōu)良的基因快速純合，獲得性狀優(yōu)良的純系，進而提高玉米育種的效率，該方法將會成為改良自交系的主要方法。

玉米孤雌生殖現(xiàn)象是極其復雜的生理、生化過程。化學藥物誘導玉米孤雌生殖可以極大地提高結實率，但由于材料和藥物不同，具體到平均結實率又高低不一，誘導效果也隨所用藥物的不同而不同，普遍認可的藥物及濃度組合為0.01%DMSO與0.01%DMSO＋0.01%甲烷磺酸；藥物使用方法以注射略好，可能與藥物與胚囊接觸時間的長短有關；材料基因型與純合度也造成了誘導效果的顯著不同，其大小順序為群體＞雜交組合＞中間育種材料＞自交系，說明材料的純合度與誘導效果呈負相關。誘導系誘導玉米孤雌生殖的方法簡便易行，影響其結果的主要因素有：同一誘導系誘導遺傳背景或雜種優(yōu)勢類群材料間的誘導率差異較大，但具體關系仍不明確；不同環(huán)境對誘導的結果影響較大，如在我國海南冬季的單倍體誘導率明顯高于北方地區(qū)；長花絲的平均誘導率明顯大于短花絲的平均誘導率；伏后授粉平均誘導率明顯大于伏期授粉的平均誘導率。因此，利用玉米孤雌生殖技術選育純合系時，上述因素均應考慮。

化學藥劑和誘導系雜交誘導2種方法均是玉米進行孤雌生殖育種的有效方法，2種方法各有利弊，在實際應用中，研究人員應根據(jù)自己的材料、人力、物力、土地等條件的具體情況來選擇合適的方法，避免資源浪費和試驗失敗。

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