miRNA在多囊卵巢綜合征發病中的作用機制研究進展

張攀，孫艷美,張萍萍，張寧，苗繪，李亞麗

(河北省人民醫院，石家莊 050071)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是青春期、育齡期及絕經過渡期女性最常見的一種生殖功能障礙與代謝異常并存的內分泌紊亂綜合征，是引起無排卵性不孕的主要原因，其主要臨床特點是無排卵、高雄激素血癥、胰島素抵抗(IR)，在女性人群中患病率為5%～22%，在育齡期女性中發病率可達15%，約占無排卵性不孕癥的75%。PCOS不僅可以引起女性生殖功能障礙和內分泌代謝紊亂，還可增加2型糖尿病、心血管疾病的患病風險[1]，引起肥胖、代謝綜合癥、妊娠期糖尿病、子宮內膜癌等合并癥，這些合并癥將進一步損害生育能力并影響患病女性的心理健康。由于PCOS的臨床表現的復雜性和高度異質性，其確切病因及發病機制目前并不清楚，許多病因學因素被假定，包括基因突變、遺傳因素、內分泌失衡、環境及營養因素等。微小RNA(miRNAs)是內源性非編碼小分子RNA，作為轉錄后調控的關鍵，在正常或病理條件下的細胞和組織中起著最基本的作用，可以調控多種生物過程，包括細胞增殖、發育、分化、死亡，DNA修復、免疫功能等，參與了多種疾病的發生發展過程。研究表明，有一半以上的miRNAs位于癌相關基因組區域，提示miRNAs的異常表達在腫瘤的發生發展過程中可能起重要作用，包括肝癌、肺癌、食管癌等[2]。此外研究發現一些miRNAs的異常表達還與心血管疾病、子宮內膜異位癥、PCOS等相關。現將與PCOS有關的miRNAs及其作用機制做一綜述。

1 與PCOS相關的miRNAs

miRNAs是由19～25個核苷酸組成，高度保守的內源性非編碼小分子RNA，其表達具有時空特異性，通過對靶基因mRNA的3′非編碼區(3′UTR)的堿基配對，使mRNA降解或翻譯抑制，從而對基因表達進行調控。miRNAs大量存在于血清、卵泡液等組織中并可自由傳播，在卵巢激素的生成、卵泡發育及閉鎖過程中發揮重要作用[1]，而激素水平及卵泡發育的異常是PCOS的主要臨床特征[2]。Yang等[3]研究發現一些miRNAs通過靶向作用于TGF-β受體2，及對TGF-β/Smad信號轉導通路的作用參與并啟動了始基卵泡的生成；Maalouf等[4]研究發現一些miRNAs對原始卵泡的形成和維持起重要作用。miRNAs可能通過調節顆粒細胞的增殖、凋亡對卵泡發育產生影響。此外研究表明miRNAs的異常表達也參與了胰島素抵抗(IR)，PCOS患者的IR率達到50%～70%，且IR又被認為是PCOS發病機理的核心。miRNAs可能通過對胰島素信號通路中的關鍵性蛋白絲裂原活化蛋白激酶、胰島素樣生長因子1、胰島素受體底物、蛋白激酶B和促性腺激素釋放激素進行調控，從而使通路異常，導致IR[5]，進而促進PCOS的發生和發展。目前研究發現，miR-320a、miR-145、miR-483、miR-93在PCOS 女性中表達異常，推測這些miRNAs可能與PCOS的發病機制相關。

2 miRNAs在PCOS發病中的作用機制

2.1 miR-320a miR-320a是多種腫瘤的抑制基因，其異常性表達多與惡性腫瘤相關[6]。在女性生殖系統中miR-320a表達水平與卵母細胞發育情況緊密相關，其表達水平的正常維持是卵母細胞發育的必要條件，具有較多成熟卵母細胞患者的卵泡液中miR-320a水平更高[7]。有學者研究發現PCOS患者血清中miR-320a表達下調，卵丘細胞(CCs)中miR-320a表達明顯下調，顆粒細胞中miR-320a的表達呈上調趨勢，而miR-320a在卵泡液中的表達存在爭議，一些學者研究發現miR-320a在PCOS卵泡液中表達上調，而Sang等[8]發現miR-320a在PCOS卵泡液中表達下調。CCs和卵泡液是雌激素合成的主要場所，miR-320a在CCs中富集。Zhang等[9]檢測了幾種類固醇激素合成酶的表達，發現miR-320a抑制僅僅損害CYP11A1和CYP19A1表達，其直接針對Runx2的3′UTR通過調節Runx2/CYP11A1(CYP19A1)級聯反應來增強CCS的類固醇激素生成，推測miR-320a/Runx2/CYP11A1(CYP19A1)的級聯反應缺陷是PCOS患者CCs中雌激素合成缺乏的可能機制。此外miR-320a可靶向作用于轉錄因子E2F1和SF-1抑制雌激素的合成及顆粒細胞的增殖，促進睪酮和孕酮的產生。miR-320a不僅可以影響PCOS相關激素分泌和顆粒細胞增殖，還可以影響胰島素敏感性[10]。有研究推測miR-320a可能通過胰島素PI3K信號通路降低胰島素敏感性[11]。此外，miR-320a的表達還受到其他因素的影響。卵泡刺激素使miR-320a表達下調；miR-383具有增強miR-320a表達并增強其抑制顆粒細胞增殖的作用[10]。

2.2 miR-145 miR-145作為一種腫瘤抑制基因，可以下調各種腫瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌等發生[12]，然而miR-145在人類卵母細胞的周圍顆粒細胞(GCs)中的具體作用仍沒有報道。GCs是局部合成雌激素的主要場所，可以刺激卵泡生長，并提供內分泌信號到其他組織。最近研究發現PCOS女性存在GCs功能障礙[13]。Cai等[14]發現患有PCOS女性卵泡液分離GCs中miR-145的表達降低，且GCs中miR-145表達抑制細胞存活率和DNA合成水平，促進GCS細胞凋亡。

miR-145抑制細胞增殖的潛在機制與靶向抑制胰島素受體底物(IRS1)表達有關，IRS1是IRS家族的主要成員，在癌癥中介導細胞增殖和胰島素代謝的過程[15]。在PCOS患者，GCs細胞 IRS1基因是miR-145的靶基因，miR-145抑制IRS1蛋白表達。miR-145及其靶基因IRS1共同調節PCOS患者GCs細胞增殖。最近的研究表明，PCOS患者IRS1可以通過PI3K/AKT和MAPK/ERK兩條信號通路，調節細胞代謝及調亡，前者主要參與細胞代謝過程中的胰島素調節，后者主要是與細胞的生長、分化凋亡有關[16]。miR-145通過靶向抑制IRS1的表達抑制細胞增殖，從而抑制PCOS患者GCS的MAPK/ERK信號通路。然而高濃度的胰島素下調miR-145表達，上調IRS1表達，并促進細胞增殖。有趣的是，MAPK/ERK信號通路對PI3K信號通路的具有負反饋效應，導致PCOS患者IR的形成。這些研究表明miR-145表達不僅抑制GC增殖，也可能改善PCOS患者的IR。

2.3 miR-483 miR-483是一種在多種真核生物中存在的mi RNAs，多用于肝癌、軟骨癌、缺血性心臟病的診斷[17]。miR-483-5p是人卵泡液中含量最多的一種miRNA，可以調節孕酮水平、影響卵巢的功能。研究發現miR-483-5p在PCOS患者卵丘顆粒細胞、卵泡液中均表現為高表達，其通過Notch信號和MAPK通路靶向調控Notch3和MAPK3，在PCOS疾病發展中存在抑制作用[18]。此外研究發現miR-483-5p可以促進PCOS患者的GCs細胞的增殖，且在降低IR方面發揮重要作用[19]。miR-483-3p位于胰島素樣生長因子2基因的第二內含子內，研究表明，miR-483-3p與人類多種腫瘤相關[20]。最近研究發現PCOS患者卵丘細胞miR-483-3p表達與正常對照組相比是下降的。Xiang等[21]報道miR-483-3p可能通過靶向作用IGF1抑制人卵巢顆粒細胞(KGN細胞)增殖從而阻滯細胞周期。IGF1是胰島素相關肽，參與IR的發生發展[22]。雙熒光素酶報告基因分析表明IGF1是miR-483直接靶基因，推測IGF1是miR-483抑制 KGN細胞增殖的關鍵，其可以促進KGN細胞增殖，并通過miR-483反向抑制細胞活力。IGF1及miR-483都可被胰島素調控，對KGN細胞進行胰島素治療可以抑制miR-483表達，提高IGF-1，誘導細胞增殖。此外，CCNB1、CCND1和CDK2是3個與細胞周期阻滯相關的重要的調控因子，miR-483可以對這些因子的表達進行調控，誘導細胞周期阻滯，從而進一步抑制KGN細胞增殖[21]。

2.4 miR-93 miR-93是miRNAs的內含子，它的轉錄是集中在高度保守的微小染色體MCM7的第13區內含子[23]。研究發現miR-93表達在PCOS患者脂肪組織中存在異常，同時發現IR的脂肪細胞含有差異性表達的miRNA譜[24]。Wu等[25]的一項研究發現miR-93在PCOS和IR非PCOS女性的脂肪組織中的表達增高，但其宿主基因MCM7在PCOS患者中的表達變化卻和miR-93不一致，MCM7在這些個體脂肪組織表達均下調，且在PCOS并IR的女性中表達更低。miR-93過度表達直接抑制葡萄糖轉運蛋白4表達，降低葡萄糖代謝和胰島素敏感性，從而加重PCOS患者的IR[24]。類似于miR-93的表達，其它MCM7內含子區域內miR家族成員的表達(miR-25和miR-106b)與MCM7表達也不平行。miR-25、miR-106b只在IR女性脂肪組織中過度表達，無論是否是PCOS狀態。但是miR-25在PCOS合并 IR的女性脂肪組織中表達更高。miR-25/93/106b與宿主基因MCM7的差異性表達的可能機制包括不同轉錄的穩定性、轉錄后miRNA的調控，或miRNA內含子宿主基因的獨立表達[26]。之前報道小鼠成骨細胞miR-93單個啟動子區是在miR-93轉錄起始位點上游(TSS)的特異性鋅指蛋白轉錄因子7，是骨礦化的關鍵調節因子[27]。這些miRNAs每一個都具有自己的啟動子，Monteys等[28]研究發現一個獨立的TSS及TSS附近的miR-25、miR-93、miR-106b有不同的轉錄因子結合位點，進一步支持了這一假設。此外MCM7蛋白的表達與體內空腹血糖呈負相關，因此細胞外循環血糖對脂肪組織中miR-25/93/106b及MCM7的不一致表達起到了重要作用。這就進一步說明這些miRNAs可能有自己獨特的管理機制，在PCOS和/或IR女性表現為功能失調或異常。

RNA結合蛋白(RBPs)可以控制miRNA的生物合成、定位、活性和降解，因此對miRNA的表達有影響[26]。RBPs通常針對單個miRNA家族，起到具體的、合理的、尚未確定的作用，RBPs在miR-25/93/106b及MCM7不一致的表達中可能發揮作用，具體機制還需進一步研究。

綜上所述，PCOS是一個多因子高度異質性的綜合征。miRNAs在卵泡發育和維持生育能力方面扮演著重要角色。使用高通量分析研究PCOS患者的miRNAs發現似乎miRNAs表達沒有重疊。這種不一致再一次強調，PCOS是一個多因子和異質性的綜合征，因此識別不同的miRNAs并研究它們對PCOS疾病發生發展的作用機制對于了解PCOS的復雜表觀遺傳調控機制是非常必要的。血清及卵泡液中miR-320的差異表達使miR-320可能作為新的生物標記物，為PCOS的診治提供新的思路。然而miR-320在PCOS患者卵泡液、顆粒細胞中的差異性表達仍存在爭議，這些存在矛盾的結果可能是因為研究個體及實驗方法的不同，因此對miR-320在PCOS中的表達及具體作用機制有待進一步研究。研究認為miR-145是改善PCOS患者GCS功能障礙的一個新的有前途的分子靶點，然而miR-145調節IR的精確機制值得進一步研究。研究表明miRNA-483-5p在PCOS疾病發展中存在抑制作用，miR-483-3p被證明可能通過抑制胰島素樣生長因子1抑制KGN細胞增殖和阻滯細胞周期，這意味著miR-483可以作為新的診斷PCOS的潛在生物標志物，并為PCOS的治療提供新思路。此外，miR-25/93/106b在IR和/或PCOS發展中扮演著一個重要角色，但需要進一步的研究確定miR-25/93/106b對PCOS疾病的發展是否有促進作用及RBPs在這個過程中是否參加。通過對這些miRNAs的目標基因及作用通路的研究，將有助于更好地了解miRNAs在PCOS發病機制中的作用。

[1] Pinola P, Puukka K, Piltonen TT, et al. Normo- and hyperandrogenic women with polycystic ovary syndrome exhibit an adverse metabolic profile through life[J]. Fertil Steril, 2017,107(3):788-795.

[2] Munker R, Calin GA. MicroRNA profiling in cancer[J]. Clin Sci (Lond), 2011,121(4):141-158.

[3] Yang S, Wang S, Luo A, et al. Expression patterns and regulatory functions of microRNAs during the initiation of primordial follicle development in the neonatal mouse ovary[J]. Biol Reprod, 2013,89(5):126.

[4] Maalouf SW, Liu WS, Pate JL. MicroRNA in ovarian function[J]. Cell Tissue Res, 2016,363(1):7-18.

[5] Chakraborty C, Doss CG, Bandyopadhyay S, et al. Influence of miRNA in insulin signaling pathway and insulin resistance: micro-molecules with a major role in type-2 diabetes[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2014,5(5):697-712.

[6] Chen C, Zhao Z, Liu Y, et al. microRNA-99a is downregulated and promotes proliferation,migration and invasion in non-small cell lung cancer A549 and H1299 cells[J]. Oncol Lett, 2015,9(3):1128-1134.

[7] Scalici E, Traver S, Mullet T, et al. Circulating microRNAs in follicular fluid, powerful tools to explore in vitro fertilization process[J]. Sci Rep, 2016,22(6):24976.

[8] Sang Q, Yao Z, Wang H, et al. Identification of microRNAs in human follicular fluid: characterization of microRNAs that govern steroidogenesis in vitro and are associated with polycystic ovary syndrome in vivo[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2013,98(7):3068-3079.

[9] Zhang CL, Wang H, Yan CY, et al. Deregulation of RUNX2 by miR-320a deficiency impairs steroidogenesis in cumulus granulosa cells from polycystic ovary syndrome (PCOS) patients[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017,482(4):1469-1476.

[10] Surrey ES. Endometriosis-Related Infertility:The Role of the Assisted Reproductive Technologies[J]. Biomed Res Int, 2015,2015:482959.

[11] Hamdan M, Dunselman G, Li TC, et al. The impact of endometrioma on IVF/ICSI outcomes:a systematic review and meta-analysis[J]. Hum Reprod Update, 2015,21(6):809-825.

[12] Ding W, Tan HB, Zhao C, et al. MiR-145 suppresses cell proliferation and motility by inhibiting ROCK1 in hepatocellular carcinoma [J] . Tumour Biol, 2016，37(5):6255-6260.

[13] Artimani T, Saidijam M, Aflatoonian R, et al. Estrogen and progesterone receptor subtype expression in granulosa cells from women with polycystic ovary syndrome [J]. Gynecol Endocrinol, 2015,31(5):379-383.

[14] Cai G, Ma X, Chen B, et al. MicroRNA-145 Negatively Regulates Cell Proliferation Through Targeting IRS1 in Isolated Ovarian Granulosa Cells From Patients With Polycystic Ovary Syndrome[J]. Reprod Sci, 2017,24(6):902-910.

[15] Aleem E, Nehrbass D, Klimek F, et al. Upregulation of the insulin receptor and type I insulin-like growth factor receptor are early events in hepatocarcinogenesis[J]. Toxicol Pathol, 2011,39(3):524-543.

[16] Ma WC, Liu JX, Chen DS. Research progress of molecular mechanisms of two main signaling pathways for insulin resistance in polycystic ovary syndrome[J]. Acta Acad Emedicinae Qingdao Uniwersitatis, 2015,51(6):745-747.

[17] Li F, Ma N, Zhao R, et al. Overexpression of miR-483-5p/3p cooperate to inhibit mouse liver fibrosis by suppressing the TGF-b stimulated HSCs in transgenic mice[J]. J Cell Mol Med, 2014,18(6):966-974.

[18] Xu B, Zhang YW, Tong XH, et al. Characterization of microRNA profile in human cumulus granulosa cells:Identification of microRNAs that regulate Notch signaling and are associated with PCOS[J]. Mol Cell Endocrinol, 2015,15(404):26-36.

[19]Shi L, Liu S, Zhao W, et al. miR-483-5p and miR-486-5p are down-regulated in cumulus cells of metaphase II oocytes from women with polycystic ovary syndrome[J]. Reprod Biomed Online, 2015，31(4):565-572.

[20] Yi C, Wang Q, Wang L, et al. MiR-663, a microRNA targeting p21 (WAF1/CIP1),promotes the proliferation and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncogene, 2012,31(41):4421-4433.

[21] Xiang Y, Song Y, Li Y, et al. miR-483 is Down-Regulated in Polycystic Ovarian Syndrome and Inhibits KGN Cell Proliferation via Targeting Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF1)[J]. Med Sci Monit, 2016,23(22):3383-3393.

[22] Djiogue S, Nwabo-Kamdje AH, Vecchio L, et al. Insulin resistance and cancer: The role of insulin and IGFs[J]. Endocr Relat Cancer, 2013,20(1):1-17.

[23] Long J, Wang Y, Wang W, et al. Identification of microRNA-93 as a novel regulator of vascular endothelial growth factor in hyperglycemic conditions[J]. J Biol Chem, 2010,285(30):23457-23465.

[24] Chen YH, Heneidi S, Lee JM, et al. miRNA-93 inhibits GLUT4 and is overexpressed in adipose tissue of polycystic ovary syndrome patients and women with insulin resistance[J]. Diabetes, 2013,62(7):2278-2286.

[25] Wu HL, Heneidi S, Chuang TY, et al. The Expression of the miR-25/93/106b Family of MicroRNAs in the Adipose Tissue of Women With Polycystic Ovary Syndrome[J]. J Clin Endocrinlo Metab, 2014,99(12):2754-2761.

[26] van Kouwenhove M, Kedde M, Agami R. MicroRNA regulation by RNA-binding proteins and its implications for cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2011,11(4):644-656.

[27] Li Y, Deng C, Chao C, et al. miR-93/Sp7 function loop mediates osteoblast mineralization[J]. J Bone Miner Res, 2012,27(5):1598-1606.

[28] Monteys AM, Spengler RM, Wan J, et al. Structure and activity of putative intronic miRNA promoters[J]. RNA, 2010,16(7):495-505.