疲勞、饑餓輔助大腸桿菌上行感染法建立大鼠盆腔炎后遺癥模型

于瀟，劉鵬飛，劉金星，王麗，師偉，呂姝菡，丁怡，王憲，王玉超

(1山東中醫藥大學，濟南 250000；2山東中醫藥大學附屬醫院；3濟南大學)

目前國內外對盆腔炎后遺癥(SPID)進行研究時，SPID動物模型多采用開腹手術法制備[1]，通過機械損傷子宮內膜并注入大腸桿菌的方法造模，與SPID臨床發病過程不符[2]。目前國內外尚無符合SPID臨床發病過程的SPID動物模型構建方法，探討行之有效的SPID動物模型造模方法非常有必要。SPID臨床發病過程中病原菌是經陰道上行感染。疲勞、饑餓可以降低免疫力，促進炎癥進程。2015年1月～2016年2月，我們用運動性疲勞、饑餓輔助大腸桿菌上行感染的方法制備大鼠SPID模型，效果滿意。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 SPF級雌性已育Wistar大鼠32只，體質量(220±20)g，鼠齡12 周，購自山東濟南朋悅動物實驗公司。大鼠分籠飼養，自由飲食和飲水，動物房內溫度(20±2)℃，相對濕度為40%～60%。大腸桿菌標準菌株(菌株號ATCC35218)由山東中醫藥大學附屬醫院微生物室提供；營養瓊脂由山東中醫藥大學附屬醫院微生物室提供；麻醉劑1%戊巴比妥鈉、無菌生理鹽水、10%中性甲醛由山東中醫藥大學附屬醫院病理科提供。Proline 微量移液器(蘇州BIOHIT公司)，NW10LVF 超純水系統(香港Heal Force公司)。

1.2 造模方法 常規飼養1周后，開始造模。大鼠持續進行負重(5%體質量)游泳，至大鼠出現身體下沉、運動協調性明顯下降、水淹沒鼻尖至再次浮出水面時間超過10 s[3.4]，連續12天。然后暴露大鼠陰道，用一次性移液槍頭注入6×106/mL大腸桿菌懸液0.5 mL，待液體被陰道黏膜完全吸收后放回籠內。1次/d，連續進行10天。其間隔天投喂1次[5]。每日投喂量嚴格控制為大鼠體質量的10%，飲水不受限制。

1.3 造模效果觀察方法 造模過程中觀察各組大鼠皮毛顏色、色澤、皮毛狀態、雙眼狀態、精神狀態、食量及肛周清潔度的變化。造模完成后用1%戊巴比妥鈉(劑量50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，牽拉大鼠四肢及頭部固定于操作臺上，剪去下腹部的皮毛，并用碘伏消毒。在無菌條件下，取下腹部正中切口長約 1 cm，開腹后暴露雙側子宮、輸卵管、卵巢及其周圍結締組織，肉眼觀察局部病理形態后摘取輸卵管、卵巢及部分外周結締組織，置于10%中性甲醛中保存。肉眼觀察輸卵管有無充血、增粗、阻塞、積水，輸卵管卵巢有無粘連、腫塊或囊腫形成，盆腔結締組織有無增生、粘連、滲出等情況。將各組大鼠輸卵管、卵巢和周圍結締組織切片進行常規HE染色，定性描述局部顯微結構的改變情況。

2 結果

造模過程中可見大鼠皮毛粗糙、稀疏成縷，色黃，精神不振，雙眼黯淡無神，雙耳色黯，對外界刺激反應遲鈍，食欲下降，體質量減輕，陰道分泌物增多，大便質稀，有肛周污染。造模完成后取大鼠輸卵管、卵巢及周圍結締組織大體觀察，可見輸卵管顏色暗紅、迂曲質硬，或有輸卵管積水，黏膜組織瘀點，盆腔內有廣泛纖維組織粘連，部分可見透明樣卵巢囊腫。鏡下觀察大鼠輸卵管管腔有不同程度擴張，黏膜層皺襞平坦，腔內可見大量粉染液體，部分輸卵管壺腹部皺襞增生，融合；見少量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、漿細胞和單核細胞為主，伴周圍結締組織增生，細胞走行紊亂，腺體、間質結構破壞，部分腺體壞死，外周血管擴張。

3 討論

SPID是盆腔炎未得到及時正確治療而發生的女性上生殖道及其周圍組織破壞、廣泛粘連、增生及瘢痕形成等一系列后遺癥，即既往稱謂的慢性盆腔炎[6]。因盆腔炎臨床癥狀輕重的異質性較大，常就診不及時、治療不全面，易發展為SPID，由其導致的不孕占不孕患者的20%～30%，SPID患者異位妊娠率是正常女性8～10倍，約20%患者遺留慢性盆腔痛，且易反復發作[7，8]，嚴重影響女性生活質量。

目前國內多采用開腹手術法制備SPID動物模型，即經“腹壁-子宮壁-子宮-輸卵管”的途徑注入菌液，并配合機械輕微損傷宮腔組織[1]，明顯與SPID臨床發病過程不符。目前國內外尚無符合臨床發病過程的明確的SPID動物模型，未明確區分盆腔炎與SPID，仍以盆腔炎模型代替SPID研究。模擬SPID臨床發病條件，建立相應動物模型，對研究SPID的發病機制和治療方法有重要意義。

造模動物選擇的基本要求是選擇具有與人類相似的內生殖器官結構的哺乳動物，家兔和大鼠是國內外研究的主要實驗動物[1,9]。大鼠子宮在盆腔中占有很大的比例，病理現象觀察較為方便[1]。采用大鼠作為SPID造模動物，具有操作簡便、結果穩定和成本低廉等優勢。感染源種類方面，國內以內源性混合病原體為主。國外學者認為SPID造模應采取單一病原體，因其致病因素明確，能較好重現SPID的臨床病理過程[10]。陳磊等[11]報道SPID最常見的病原菌是大腸桿菌和表皮葡萄球菌。故本研究感染實驗組選用的病原菌是大腸桿菌。

要制作符合臨床證候的SPID動物模型，除陰道內接種病原菌模擬陰道上行感染外，還需耗傷正氣，使其抗病祛邪能力低下而提高成模率。疲勞因素是常用的消耗正氣的造模方法，一般以無損傷的游泳運動方式為主[12]，表現為大鼠鼻孔沒入水面以下5～10 s不能主動上浮、協調動作消失，伴有食欲低下、反應遲鈍、體毛蓬亂、精神倦乏等[3.4]。飲食不節因素也是比較常見的削奪正氣的致病因素。劉軍等[5]研究發現，應用饑餓與復食相交替的間歇性饑餓法，可使大鼠發情周期停止，垂體功能受到抑制，內分泌狀態紊亂。

本組大鼠造模后輸卵管、卵巢及周圍結締組織有明顯的盆腔炎性疾病后遺癥病理改變，提示造模成功。而且感染經過符合人SPID臨床發病過程。本研究為國家自然科學基金項目項目“盆腔炎性疾病后遺癥大鼠非手術建模評價及證候屬性的研究”和山東省自然科學基金“基于無創法建模和方證相應理論的慢性盆腔炎大鼠模型評價的研究”的分支實驗。本研究結果為下一步進行SPID的相關動物研究奠定了基礎。

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