耐紫杉醇宮頸癌細(xì)胞株Hela特異性結(jié)合多肽的篩選及其功能鑒定

李倩, 左璇，鄧成程, 尹東鋒

(1新疆軍區(qū)總醫(yī)院，烏魯木齊830000；2中國(guó)人民解放軍第11醫(yī)院)

宮頸癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病數(shù)逐年增高且呈年輕化趨勢(shì)[1，2]。化療是宮頸癌常用的治療方法，但近年來耐藥宮頸癌的出現(xiàn)導(dǎo)致化療效果差，腫瘤細(xì)胞的靶向治療為宮頸癌的臨床研究提供了一條新的思路。尋找高效、高特異性和靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的治療藥物已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3，4]。多肽是由三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物，具有分子量小、特異性強(qiáng)、可降解及無免疫原性等特點(diǎn)。靶向多肽對(duì)于腫瘤細(xì)胞具有高度特異性和親和力。噬菌體展示是一種篩選多功能性多肽的生物技術(shù)，將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面[5，6]。2016年8～2017年10月,我們通過噬菌體展示技術(shù)，從肽庫中篩選出與耐紫杉醇(PTX)的宮頸癌Hela細(xì)胞株(Hela/PTX)有高度親和力的多肽，并鑒定其與Hela/PTX細(xì)胞的結(jié)合力和特異性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌Hela耐藥細(xì)胞株Hela/PTX由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；骨肉瘤細(xì)胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；噬菌體隨機(jī)七肽庫(肽庫)購自英國(guó)Biolabs公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國(guó)Gibco公司；HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體單克隆抗體購自美國(guó)Amersham公司；PEG8000及IPTG/X-gal均購自北京鼎國(guó)生物有限公司。

1.2 靶向多肽的篩選 采用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela及Hela/PTX細(xì)胞培養(yǎng)至鋪板板底，Hela細(xì)胞中加入1 mL封閉液，37℃孵育1 h。加入10 μL的肽庫原液，搖動(dòng)1 h。將孵育過Hela的噬菌體混合液轉(zhuǎn)移至耐藥細(xì)胞Hela/PTX板，搖動(dòng)1 h。PBS沖洗后，加入1 mg/mL BSA分離已結(jié)合的分子，搖動(dòng)10 min，收集洗脫液，加入150 μL 1mol/L的Tris-HCl(pH值9.1)中和上述洗脫液，收集洗脫物進(jìn)行擴(kuò)增。挑ER2738單克隆于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后將培養(yǎng)物1∶100稀釋于20 mL的LB中，加入上述洗脫物。37 ℃劇烈搖動(dòng)4.5 h，離心后取上清液加入PEG/NaCl，讓噬菌體4 ℃沉淀過夜。沉淀物重懸于1 mL TBS中，離心后取上清加入PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育60 min后離心10 min，取沉淀物重懸于200 μL TBS，0.02% NaN3離心1 min，上清轉(zhuǎn)入新鮮管中，此即為擴(kuò)增后的洗脫物。用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴(kuò)增后的洗脫物，計(jì)數(shù)其中噬菌體陽性克隆數(shù)量，然后4 ℃貯存[7]。共進(jìn)行3次篩選。

將3輪篩選后獲得的洗脫物送蘇州金唯智生物科技有限公司，用ELISA法檢測(cè)洗脫物中多肽與Hela/PTX細(xì)胞親和力(以P/N表示)，選取P/N值最大的10條多肽進(jìn)行測(cè)序，命名其中P/N值最大的一條多肽，將其序列交上海吉爾多肽公司合成。

1.3 所得靶向多肽的功能鑒定 采用質(zhì)譜法測(cè)量所得靶向多肽的分子量。用細(xì)胞親和力實(shí)驗(yàn)觀察所得多肽與Hela/PTX細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞的結(jié)合能力。用0.25%胰酶消化Hela/PTX細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞，以4×105/孔的密度均勻接種在12孔板，孵育過夜，使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%。換無血清的DMEM 培養(yǎng)基，用無血清的DMEM將靶向多肽稀釋至200 μg/mL，每孔加入0.5 mL稀釋好的多肽溶液，輕輕搖動(dòng)12 孔板使多肽混合均勻，孵育2 h后PBS 沖洗2 遍，加入新鮮培養(yǎng)基，倒置熒光顯微鏡下觀察[8]。

2 結(jié)果

經(jīng)過3輪競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)最終獲得86 個(gè)克隆。ELISA結(jié)果顯示其中P/N值最大的一個(gè)P/N值為3.2，命名為EP-7，測(cè)序獲得其氨基酸序列為Glu-Arg-Thr-Ile-Ser-Leu-Pro(ERTISLP)。

質(zhì)譜分析顯示EP-7分子量為815.30 D。細(xì)胞親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hela/PTX 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有綠色熒光，而骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)未觀察到綠色熒光，表明多肽EP-7可以與Hela/PTX 細(xì)胞結(jié)合而不能與骨肉瘤細(xì)胞結(jié)合。

3 討論

宮頸癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病數(shù)逐年增高且呈年輕化趨勢(shì)[9～11]。化療是宮頸癌常用的治療方法，但近年來耐藥宮頸癌的出現(xiàn)及嚴(yán)重的毒副作用導(dǎo)致治療效果效果差。腫瘤細(xì)胞的靶向治療能夠選擇性作用于病變部位，控制藥物的分布與釋放，提高藥效和降低毒副作用，為宮頸癌的臨床研究提供了一條新的思路[12]。目前臨床研究顯示可以通過以下4種途徑實(shí)現(xiàn)遞藥系統(tǒng)的主動(dòng)靶向性：①以抗體為靶標(biāo)的主動(dòng)靶向系統(tǒng)[13]；②配體-受體主動(dòng)靶向系統(tǒng)[14]；③多肽/蛋白質(zhì)配體修飾的主動(dòng)靶向系統(tǒng)[15]；④維生素類如葉酸[16]等配體修飾的主動(dòng)靶向系統(tǒng)。

多肽是由三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸分子脫水縮合以肽鏈連接在一起而成的化合物，具有分子量小、特異性強(qiáng)、可降解及無免疫原性等特點(diǎn)[17]。探索能與Hela細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽分子作為蛋白標(biāo)簽對(duì)于研究宮頸癌的靶向治療方法具有重要意義。為了實(shí)現(xiàn)遞藥系統(tǒng)的主動(dòng)靶向性，提高化療藥物在病灶的分布，本研究通過噬菌體展示技術(shù)篩選并合成出一種與Hela/PTX細(xì)胞膜表面分子結(jié)合的多肽。

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面[18 ]。我們以此原理為基礎(chǔ)，以Hela/PTX細(xì)胞為靶細(xì)胞，選用噬菌體隨機(jī)七肽庫進(jìn)行三輪篩選，從所得的噬菌體克隆中選擇挑選P/N值最大的10個(gè)進(jìn)行測(cè)序，并篩選出其中一條P/N值最高的多肽，命名為EP-7，其P/N值高達(dá)3.2，序列為Glu-Arg-Thr-Ile-Ser-Leu-Pro(ERTISLP)。該多肽與Hela/PTX細(xì)胞有高度特異性和親和力，以此多肽作為靶向頭基，能夠?qū)崿F(xiàn)遞藥系統(tǒng)的主動(dòng)靶向性；且該多肽與腫瘤細(xì)胞結(jié)合可能會(huì)抑制細(xì)胞膜的某些功能，可能會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者與化療藥物有協(xié)同作用，具有治療效果，可用于腫瘤的靶向治療。抗腫瘤藥物及其遞藥系統(tǒng)經(jīng)過靶向多肽修飾，可增加藥物的腫瘤主動(dòng)靶向性，達(dá)到更有效、精確和安全的治療，提高患者依從性[19]。然而，由于腫瘤細(xì)胞表面的生物活性分子非常復(fù)雜，導(dǎo)致噬菌體與細(xì)胞的非特異性結(jié)合較高，篩選的結(jié)果不是很理想[20]。靶向多肽在腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)中的研究還不夠成熟，還需要做大量的前期研究才能實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。相信隨著多肽及相關(guān)衍生物的大量出現(xiàn)和篩選技術(shù)的不斷發(fā)展，可以得到與腫瘤細(xì)胞具有極高度特異性和親和力的靶向多肽，從而進(jìn)一步推進(jìn)多肽在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。

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