circRNA生物學(xué)特性及其與肺癌關(guān)系的研究進(jìn)展

鐘瓊慧，林晉，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌330006)

環(huán)狀RNA(circRNA)是繼微小RNA(miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)后被發(fā)現(xiàn)的另一種內(nèi)源性非編碼RNA，是RNA家族又一新的研究熱點(diǎn)。circRNA是一類通過反式剪接使得3′末端與5′末端共價(jià)結(jié)合形成的環(huán)狀RNA分子，具有序列保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高和特異性高的特性。circRNA具有多項(xiàng)生物學(xué)功能，能夠調(diào)控肺癌驅(qū)動(dòng)基因和免疫治療靶點(diǎn)。本文對(duì)circRNA的生物學(xué)特性及其與肺癌的關(guān)系作一綜述，以期為circRNA在肺癌中的潛在作用提供新的思路和理論依據(jù)。

1 circRNA的生物學(xué)特性

1.1 circRNA的結(jié)構(gòu)與形成機(jī)制 circRNA被廣泛認(rèn)知為非編碼RNA，但其確切的分子形成機(jī)制尚不明確。circRNA不同于線性RNA分子的生成機(jī)制，其分子沒有5′端“帽子結(jié)構(gòu)”和3′端“多聚腺苷尾”，而是以共價(jià)閉合環(huán)狀的形式結(jié)合在一起。由于這種閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circRNA不容易被核酸外切酶降解而穩(wěn)定存在[1]。circRNA分子以共轉(zhuǎn)錄的方式產(chǎn)生，且其生成速率主要由其內(nèi)含子序列決定。盲肌蛋白是與circRNA生物合成相關(guān)的一個(gè)因子，盲肌蛋白與側(cè)翼內(nèi)含子相互作用，促進(jìn)外顯子環(huán)化[2]。也就是說，機(jī)體內(nèi)相當(dāng)一部分circRNA以犧牲正常RNA為代價(jià)來生成。因此，circRNA的生成對(duì)于基因表達(dá)具有巨大影響，從而參與機(jī)體發(fā)育。

1.2 circRNA的分類 circRNA可能來自外顯子或內(nèi)含子，導(dǎo)致形成四種不同類型的circRNA分子。①外顯子來源的circRNA(ecRNA)：ecRNA的形成是mRNA前體剪接的結(jié)果，是3′剪接供體與5′剪接受體結(jié)合而形成的[3]。②外顯子-內(nèi)含子來源的circRNA(EIciRNA)：在circRNA的生成過程中，內(nèi)含子可能不會(huì)被完全切除，而是被保留在新生成circRNA中被包圍的外顯子之間；上游外顯子的起始點(diǎn)與下游外顯子的末端連接，使中間的RNA發(fā)生了環(huán)化，由此產(chǎn)生了EIciRNA[3]。③內(nèi)含子來源的circRNA(ciRNA)：在Ⅰ組內(nèi)含子、Ⅱ組內(nèi)含子、剪接體剪接和tRNA剪接的情況下，從前體RNA切除的序列可以形成環(huán)狀分子，這些被切除的內(nèi)含子中有一些可能是功能性RNA。功能性RNA在分支點(diǎn)2′-5′連接處被環(huán)化，從3′端降解到分支點(diǎn)，但以某種方式逃脫脫支和降解，因此形成ciRNA[4]。④基因間來源的cicrRNA[5, 6]：基因間來源的cicrRNA含有兩個(gè)由GT-AC剪接信號(hào)側(cè)接的內(nèi)含子circRNA片段，充當(dāng)環(huán)形連接的剪接供體和受體，同時(shí)形成整合的circRNA。這種circRNA是通過circRNA Identifier檢測(cè)到的[7]。目前發(fā)現(xiàn)的circRNA主要來源于基因外顯子，占已鑒定的circRNA的80%以上[5, 8, 9]，但多項(xiàng)研究表明，circRNA的類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止上述四種，仍有待進(jìn)一步研究。

1.3 circRNA的特征 ①豐度高。在一些情況下，circRNA的豐度是相關(guān)線性mRNA豐度的10倍以上[3,6]。Jeck等[5]發(fā)現(xiàn)，在人成纖維細(xì)胞中circRNA占活躍轉(zhuǎn)錄基因的14.4%。②穩(wěn)定性高、半衰期長(zhǎng)。相比線性RNA分子，circRNA分子以首尾相接的閉合環(huán)狀形式結(jié)合在一起，不容易被核酸外切酶降解而穩(wěn)定存在。Li等[10]發(fā)現(xiàn)，circRNA在血清外泌體中是穩(wěn)定存在的，其形態(tài)依舊是完整的圓形環(huán)狀。大部分circRNA的半衰期長(zhǎng)于mRNA，大多數(shù)物種的circRNA半衰期超過48 h[5]，而mRNA的半衰期在10 h左右[11]。③序列保守性高。大多數(shù)circRNA在進(jìn)化上序列保守[12]，僅有少數(shù)物種在進(jìn)化上不保守[6, 9]。circRNA在物種間是保守的，如人類circ-Foxo3和小鼠circ-Foxo3的序列有91%是同源的[13]。④組織特異性高[9]。Memczak等[9]檢測(cè)了數(shù)千種circRNA，發(fā)現(xiàn)其通常表現(xiàn)為組織發(fā)展階段特異性。如CDR1as在腦組織中高表達(dá)，但在非神經(jīng)組織中表達(dá)很低或甚至無表達(dá)。hsa-circRNA 2149由CD19+白細(xì)胞中13個(gè)獨(dú)特的頭對(duì)尾跨越讀段表達(dá)，但在CD34+白細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中未檢測(cè)到其表達(dá)[10]。⑤大多數(shù)來源于外顯子、少部分來源于內(nèi)含子[13]。在單細(xì)胞生物中，circRNA主要來源于核糖體RNA前體的自剪接內(nèi)含子[14]，也可能來自于古細(xì)菌的蛋白質(zhì)編碼基因[15]。

1.4 circRNA的功能 ①“海綿”作用。miRNA“海綿”是一種在細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生連續(xù)miRNA功能喪失的手段。miRNA可以與circRNA結(jié)合，發(fā)揮其“海綿”作用。ciRS-7是用于miR-7海綿的環(huán)狀RNA[16]ciRS-7/CDR1as有約70個(gè) miR-7結(jié)合位點(diǎn)，可以靶向 miR-7，從而抑制其生物功能。ciRs-7也被稱為小腦變性相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄物(CDR1as)的反義物，其在人和小鼠腦中高度表達(dá)，在斑馬魚中敲低miR-7或表達(dá)ciRs-7能夠抑制中腦發(fā)育[9]。雖然circRNA被認(rèn)為具有miRNA“海綿”作用，但這是否是circRNA的一個(gè)普遍特征仍存在爭(zhēng)議[17]。②調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。circRNA可以通過與線性剪接相互競(jìng)爭(zhēng)而在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，有一類特殊的circRNA能與RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)作用，通過小干擾RNA(siRNAs)或基于RNase H的反義寡核苷酸(ASOs)靶向EIciRNA，導(dǎo)致circEIF3J和circPAIP2基因表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致HeLa和HEK293細(xì)胞中親本基因mRNA表達(dá)降低[18]。研究表明，非編碼內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄物(ci-ankrd52)對(duì)其親代編碼基因的順式調(diào)控作用，與延伸PolⅡ機(jī)制相關(guān)聯(lián)，并作為PolⅡ轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控因子[6]。③與蛋白質(zhì)相互作用。circRNA可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)功能[2,9,13]。circMbl兩側(cè)內(nèi)含子中有許多甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)的結(jié)合位點(diǎn)，并且蛋白質(zhì)與circMbl之間有強(qiáng)烈而直接的相互作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)過量時(shí)，可以通過促進(jìn)circMbl產(chǎn)生而減少自身mRNA生成，以此平衡兩者的產(chǎn)物生成[2]。另外，在保守的核苷酸中circRNA序列豐富，表明circRNA能與RNA結(jié)合蛋白(RBP)作用[9]。④翻譯功能。circRNA通常被認(rèn)為是非編碼RNA[19]，無法進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。但近期有研究報(bào)道，circRNA是可以被翻譯的，真核細(xì)胞核糖體可以啟動(dòng)在circRNA上的翻譯，但只有在RNA含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)元件的情況下才能進(jìn)行[20]。水稻黃斑病毒相關(guān)病毒體來源的高度共價(jià)閉合環(huán)狀RNA(220 nt)可以編碼16 kDa的高度堿性蛋白質(zhì)；這種circRNA是所有已知的類病毒和擬病毒中最小的，也是唯一編碼蛋白質(zhì)的，其序列具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，可通過兩個(gè)(或三個(gè))完全重疊的開放閱讀框直接進(jìn)行翻譯(在每輪結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)移到新的閱讀框)[21]。

2 circRNA與肺癌的關(guān)系

大多數(shù)原發(fā)于肺部的肺癌稱為原發(fā)性肺癌，絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管上皮組織。分子生物學(xué)認(rèn)為，肺癌與原癌基因的突變或抑癌基因的失活有關(guān)。WHO將肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，前者組織學(xué)分類包括鱗癌、腺癌(包括肺泡細(xì)胞癌)和大細(xì)胞癌三大類。circRNA與NSCLC及SCLC的發(fā)生、發(fā)展均密切相關(guān)。

2.1 circRNA與NSCLC 與相鄰的正常組織相比，NSCLC組織存在異常表達(dá)的circRNA。Yao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)circRNA_100876的NSCLC患者總生存時(shí)間短于低表達(dá)者。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌(LAC)組織中hsa_circ_0012673表達(dá)高于相鄰的非腫瘤組織，并且與腫瘤大小相關(guān)。hsa_circ_0012673主要定位于細(xì)胞質(zhì)，通過在LAC靶向erb-b2受體酪氨酸激酶3 (ErbB3)的miR-22海綿作用來促進(jìn)LAC細(xì)胞增殖。Zhu等[24]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0013958水平與NSCLC 患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并通過miR-134海綿作用上調(diào)致癌細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，在LAC的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。hsa_circ_0013958可以作為潛在的非侵入性生物標(biāo)志物用于LAC的早期檢測(cè)和篩選。Zhao等[25]發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_404833和hsa_circRNA_406483可能是肺腺癌的早期診斷標(biāo)志物，hsa_circRNA_404833可能與miR-149-5p相互作用，從而降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，并參與肺腺癌獲得性吉非替尼耐藥機(jī)制。circRNA與NSCLC的癌變密切相關(guān)，可能成為NSCLC潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

2.2 circRNA與SCLC SCLC的惡性程度高于NSCLC，容易發(fā)生淋巴結(jié)及臟器轉(zhuǎn)移，治療以全身化療為主。ETS轉(zhuǎn)錄家族中FLI1基因來源的circFLI1 E2-4和circFLI1 E2-5在SCLC組織中表達(dá)上調(diào)，相較于NSCLC，circRNA對(duì)SCLC的影響更加顯著。circFLI1 E2-4和circFLI1 E2-5均與SCLC的轉(zhuǎn)移有關(guān)，但對(duì)SCLC細(xì)胞增殖、凋亡無明顯影響，且患者化療緩解后二者表達(dá)均下降。由此可見，circRNA不僅可以作為SCLC的診斷靶標(biāo)，還可能成為SCLC患者預(yù)后的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，circRNA序列保守、含量豐富，具有組織發(fā)展階段特異性，具有miRNA“海綿”、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、結(jié)合蛋白及翻譯等多種生物學(xué)功能。目前，在肺癌中的研究多在于發(fā)現(xiàn)和篩選相關(guān)異常的circRNA等方面，隨著研究的深入將會(huì)在分子機(jī)制及信號(hào)通路方面進(jìn)行更全面地發(fā)掘。circRNA作為一種新型的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA，還有很多更深層次的生物學(xué)特性及分子作用機(jī)制有待探討。circRNA憑借其高穩(wěn)定性、高度保守、高豐度特性，有望成為新一代肺癌分子診斷的靶標(biāo)及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的新研究熱點(diǎn)。