與肝纖維化相關(guān)的長鏈非編碼RNA的研究進(jìn)展

胡存梁，陳尼維

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海 200233)

肝纖維化是肝臟組織損傷后修復(fù)失調(diào)的結(jié)果，其病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[1～3]。各種原因所致的慢性肝損傷，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(HSC)被活化并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維樣細(xì)胞，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，包括α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原α1(COL1α1)，并釋放促炎因子和促纖維化因子[4～6]。其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是主要的促纖維化因子，TGF-β-Smad信號通路是調(diào)控肝纖維化的重要細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[7,8]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指分子量大于200個(gè)核苷酸的RNA，能通過多種途徑調(diào)控基因表達(dá)，參與染色體重塑、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等過程[9]。lncRNA表達(dá)異常參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其是在器官纖維化、腫瘤方面[10～14]。本文對lncRNA與肝纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 促肝纖維化lncRNA

1.1 Alu介導(dǎo)的p21轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(APTR) p21基因位于染色體6p21.2，其編碼的蛋白p21是位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子，具有抑制細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的作用，而APTR內(nèi)輔助元件Alu是APTR結(jié)合到p21所必須的。Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，APTR在人、小鼠纖維化肝組織以及活化的HSCs中表達(dá)上調(diào)。敲除APTR基因能夠抑制體外培養(yǎng)的HSC活化，且能減輕體內(nèi)膠原蛋白(α-SMA、COL1α1)的堆積。另外，敲除APTR基因能夠增加HSC內(nèi)p21表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖，導(dǎo)入p21 siRNA1至HSC能夠減弱這一抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p21在肝纖維化模型中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)隨APTR表達(dá)增加而下降，APTR能招募多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)結(jié)合到p21啟動子，從而抑制p21表達(dá)，最終抑制HSC活化與增殖[16]。肝纖維化患者血清APTR水平升高，提示APTR是診斷和治療肝纖維化的潛在標(biāo)志物。

1.2 由TGF-β激活的lncRNA(lncRNA-ATB) lncRNA-ATB是TGF-β信號通路的重要調(diào)節(jié)因子。在丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)肝纖維化患者的肝臟組織、血清及HSC中l(wèi)ncRNA-ATB水平均上調(diào)，敲除HSC中l(wèi)ncRNA-ATB基因能抑制HSC活化(α-SMA和COL1α1表達(dá)減少)[17,18]。lncRNA-ATB作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)可促進(jìn)HCV相關(guān)肝纖維化，作用機(jī)制主要包括以下幾點(diǎn)。首先，lncRNA-ATB能競爭性結(jié)合miR-425-5p，抑制miR-425-5p，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因TGF-β RⅡ和SMAD2表達(dá)，激活TGF-β信號通路，最終使HSC活化和增殖[17]；其次，在HCV相關(guān)肝纖維化患者肝臟組織及活化的HSC中miR-200a表達(dá)下降、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)上調(diào)，當(dāng)敲除lncRNA-ATB后，miR-200a表達(dá)上調(diào)、β-catenin表達(dá)下調(diào)，同時(shí)抑制人LX-2細(xì)胞(HSC細(xì)胞系)活化[18]。β-catenin是miR-200a的靶目標(biāo)[19]，lncRNA-ATB作為ceRNA，與miR-200a結(jié)合使其不能抑制β-catenin表達(dá)，而β-catenin可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化[20]。另外，HCV相關(guān)肝纖維化患者肝纖維化程度越嚴(yán)重，其血清lncRNA-ATB水平越高[17]。因此，lncRNA-ATB可能成為診斷和治療HCV相關(guān)肝纖維化的靶標(biāo)。

1.3 HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(Hotair) Bian等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Hotair在小鼠肝纖維化模型、人纖維化肝臟組織、LX-2細(xì)胞中表達(dá)均顯著增加。上調(diào)LX-2細(xì)胞中Hotair表達(dá)可抑制人母系表達(dá)基因3(MEG3)表達(dá)，并且促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖和活化，而抑制其表達(dá)則作用相反。究其原因，一方面，Hotair通過與miR-148b競爭性結(jié)合，使miR-148b不能抑制其靶基因DNA轉(zhuǎn)甲基酶1(DNMT1)表達(dá)，導(dǎo)致DNMT1表達(dá)增加，DNMT1抑制MEG3、p53表達(dá)從而促進(jìn)HSC增殖活化[22]。另一方面，Hotair能促進(jìn)PRC2結(jié)合到MEG3啟動子上，抑制MEG3表達(dá)，最終增加HSC活性[21]。上述結(jié)果提示，Hotair抑制物可能抑制肝纖維化的發(fā)生。

1.4 肝癌細(xì)胞中上調(diào)的lncRNA(HULC) T細(xì)胞參與肝臟發(fā)生炎癥和纖維化的過程[23]。Zhao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，乙肝相關(guān)肝硬化患者血漿中調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)和HULC顯著上調(diào)。通過慢病毒載體增加T細(xì)胞內(nèi)HULC表達(dá)，能夠使Tregs/T細(xì)胞比值增加，表明HULC能促進(jìn)T細(xì)胞分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HULC能夠直接下調(diào)周期蛋白依賴激酶抑制劑p18水平，p18能夠抑制T細(xì)胞增殖，p18基因丟失導(dǎo)致T細(xì)胞增殖增加。因此，HULC可能通過直接下調(diào)p18水平促進(jìn)T細(xì)胞分化從而參與肝纖維化。

2 抗肝纖維化lncRNA

2.1 人母系表達(dá)基因3(MEG3) MEG3是一種印跡基因，位于14q32，該基因編碼的lncRNA與多種人類癌癥相關(guān)。He等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化時(shí)MEG3表達(dá)下降與其啟動子發(fā)生超甲基化密切相關(guān)。MEG3表達(dá)水平在小鼠肝纖維化模型、人纖維化肝臟組織及LX-2細(xì)胞中均顯著減少。對活化的LX-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染甲基化抑制劑5-azad C或小干擾RNA(siRNA)到DNMT1基因，抑制該酶表達(dá)，從而抑制啟動子甲基化，導(dǎo)致MEG3表達(dá)顯著增加、α-SMA和COL1α1表達(dá)減少、LX-2細(xì)胞增殖被抑制。另外，TGF-β1能使LX-2細(xì)胞增殖，而MEG3表達(dá)增加可激活p53，進(jìn)而促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)，使半胱天冬酶3活化，最終導(dǎo)致LX-2細(xì)胞凋亡，表明MEG3參與LX-2細(xì)胞凋亡。提示MEG3在HSC活化及肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

2.2 生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5) GAS5最初是在生長抑制的鼠纖維原細(xì)胞中呈高表達(dá)而被發(fā)現(xiàn)，定位于人染色體1q25.1的小開放閱讀框，全長630個(gè)核苷酸。Yu等[25]首次發(fā)現(xiàn)GAS5通過GAS5/miR-222/p27軸抑制HSC活化及增殖，從而參與抗肝纖維化。GAS5在小鼠、大鼠、人的纖維化肝組織及活化的HSC中表達(dá)下降。lncRNA作為ceRNA的特點(diǎn)主要包括：發(fā)生相互作用的lncRNA與miRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)[26]；lncRNA的復(fù)制數(shù)目較miRNA多[27]。GAS5與miR-222之間的關(guān)系符合上述特點(diǎn)，因此認(rèn)為GAS5是一種ceRNA。GAS5可競爭性結(jié)合miR-222，使miR-222表達(dá)減少，p27蛋白表達(dá)增加，而p27蛋白能夠抑制細(xì)胞周期。肝纖維化時(shí)，GAS5表達(dá)下降，故miR-222表達(dá)增加，miR-222抑制p27表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HSC活化及增殖。

2.3 基因間長鏈非編碼RNA-p21(lincRNA-p21) lincRNA-p21在人、小鼠肝纖維化肝臟組織、HSC和HBV感染患者血清中表達(dá)均減少[28]。lincRNA-p21表達(dá)下降與其啟動子甲基化有關(guān)。lincRNA-p21參與抗肝纖維化與多條信號通路相關(guān)。首先，lincRNA-p21作為ceRNA，與miR-181b競爭性結(jié)合，減弱miR-181b對PTEN表達(dá)的抑制作用，增強(qiáng)PTEN表達(dá)，最終抑制HSC活化。其次，miRNA調(diào)控的Wnt/β-catenin信號通路與HSC活化相關(guān)，過度表達(dá)lincRNA-p21能抑制HSC活化和Wnt/β-catenin信號通路，這一效應(yīng)可完全被miR-17-5p抑制。因此，通過lincRNA-p21/miR-17-5p/β-catenin信號通路軸，lincRNA-p21能抑制HCS活化。故lincRNA-p21表達(dá)上調(diào)能夠抑制HSC活化和增殖，甚至將HSC從活化狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為靜止?fàn)顟B(tài)，從而顯著減少α-SMA和COL1α1水平，減輕肝纖維化的嚴(yán)重程度[28]?？傊琹incRNA-p21調(diào)節(jié)HSC活化，其有可能成為肝纖維化治療的新靶點(diǎn)。

3 lncRNA在肝纖維化診斷和治療中的應(yīng)用價(jià)值

在人體血清、血漿等體液中存在大量穩(wěn)定的lncRNA，研究循環(huán)血lncRNA表達(dá)變化與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，是為了使用無創(chuàng)性診療手段輔助甚至代替目前的有創(chuàng)診療手段。HBV相關(guān)肝纖維化患者血清lncRNA-ATB水平越高、lincRNA-p21水平越低提示肝纖維化程度越嚴(yán)重。受試者工作特征(ROC)曲線分析表明，血清lincRNA-p21對肝纖維化的診斷具有100%的敏感性和70%的特異性。證實(shí)血清lncRNA水平可反映肝纖維化的嚴(yán)重程度；lncRNA是診斷肝纖維化的潛在標(biāo)志物。

以往肝纖維化的治療主要以抗纖維化藥物為主，治療效果不佳，長期服用易引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)，且不能逆轉(zhuǎn)肝纖維化。肝源難求及肝移植后的排異反應(yīng)限制了肝移植的開展。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化時(shí)肝組織中異常表達(dá)的lncRNA參與了肝纖維化的發(fā)生。因lncRNA調(diào)控著大量的人類蛋白編碼基因，所以可以選擇特定的lncRNA干預(yù)其靶基因，從而調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。理論上，lncRNA表達(dá)增加的肝纖維化，導(dǎo)入反義核苷酸下調(diào)lncRNA，恢復(fù)其正常調(diào)節(jié)水平可治療肝纖維化；lncRNA表達(dá)下調(diào)的肝纖維化，將lncRNA導(dǎo)入體內(nèi)，如通過慢病毒載體介導(dǎo)GAS5、lincRNA-p21轉(zhuǎn)入目標(biāo)體內(nèi)可分別增加GAS5、lincRNA-p21表達(dá)，抑制肝纖維化發(fā)展。

目前動物和肝纖維化患者樣本均顯示lncRNA在肝纖維化中發(fā)揮作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確。今后的研究將致力于尋找準(zhǔn)確將lncRNA導(dǎo)入體內(nèi)并使其充分發(fā)揮作用的方法；準(zhǔn)確鑒定lncRNA的靶目標(biāo)，并使導(dǎo)入體內(nèi)的lncRNA作用于特定的與肝纖維化發(fā)病相關(guān)的靶目標(biāo)。隨著對lncRNA生理作用及其在肝纖維化發(fā)病中的作用機(jī)制的深入研究，通過調(diào)節(jié)肝纖維化患者體內(nèi)lncRNA活性治療肝纖維化有可能成為現(xiàn)實(shí)。