成都麻羊冷凍精液的制作程序

楊舒慧 ，周光明 ，王小強 ，張麟 ，李芬 ，吳永建

（1.四川省畜牧總站，四川 成都 610041；2.成都市西嶺雪農業開發有限公司，四川 大邑 611338；3.成都匯豐動物育種有限公司，四川 成都 610066；4.四川省大邑縣安仁都市現代農業產業園管委會，四川 大邑 611331）

成都麻羊，亦稱四川銅羊，是一種肉皮兼用型優良地方品種，2014年入選《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》。近年來，成都麻羊能繁母羊的存欄量逐漸下降，故亟需對成都麻羊遺傳資源進行保護。而開展冷凍精液的研制工作，將使成都麻羊的遺傳物質得到長期而低成本的保存。本文按照國家標準“GB 20557-2006山羊冷凍精液”規定程序，對成都麻羊冷凍精液的制作程序進行了實際探索。

1 精液來源

1.1 種公羊選擇 在成都市西嶺雪開發有限公司挑選體型外貌和生產性能符合品種要求的特級、一級種公羊12只。對每只公羊進行檢疫，確認無傳染病，體質健壯。

1.2 種公羊飼養 為了提高采精量、精子活力，保證精子質量，應提前30d加強種公羊的飼養管理。要求飼料營養價值高，容易消化，適口性好。

1.3 種公羊管理 種公羊需保持中上等膘情，健壯、活潑、精力充沛、性欲旺盛，過肥過瘦都不利采精。公羊必須單獨組群、飼喂，每日應有足夠的運動，運動時間以4～6h為宜。

2 采精準備

2.1 實驗室衛生要求 保持實驗室清潔衛生、無灰塵，無直射陽光，無蚊蠅，無刺激性氣味，室溫維持在25℃左右。進入實驗室的工作人員需換上干凈的工作服、鞋、帽，并佩戴一次性無菌手套。

2.2 實驗器材 采精：臺羊保定架、羊用假陰道、集精管、凡士林（或石蠟油等）、水浴鍋、溫度計、燒杯。

檢驗：恒溫載物臺、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、擦鏡紙、微量移液槍、衛生紙等。

稀釋：稀釋液原料（果糖、檸檬酸鈉、甘油、雞蛋、青霉素、鏈霉素），電子天平、三角燒杯、量筒、注射器、磁力攪拌器、濾紙、稱量紙等。

冷凍：泡沫箱、液氮、超低溫冷凍儀、細管、封口粉、脫脂棉、鑷子、細管支架、紗布袋等。

2.3 器械消毒 錐形瓶、燒杯、集精管等采用高溫干燥箱消毒；量筒、溫度計等洗凈晾干后，用紫外線照射30min消毒。

3 采精操作

參照《山羊人工授精技術操作規程》中的采精方法，采用手握法采精，取濃稠部分，顯微鏡下檢查精子活力。鮮精活力要求不低于0.65，精子畸形率不能超過15%。檢查活力時應先于37℃預熱載玻片和蓋玻片。

4 精液稀釋

4.1 冷凍稀釋液配制 基礎液：檸檬酸鈉2g、果糖4.8g、雙蒸水85mL。要求藥品純凈、稱量標準、瓶裝密封，消毒后保存。

I液：基礎液85 mL，卵黃15 mL。稀釋液每100mL中加入青霉素、鏈霉素各10萬單位。

Ⅱ液：I液中加入8%的甘油（抗凍劑）即得，用作精液第二次稀釋。

基礎液可多次使用，稀釋液需現配現用。

4.2 精液稀釋方法

4.2.1 鮮精鏡檢合格后盡快在5min內用I液作第一次稀釋，要把稀釋液加溫到28～32℃，和精液溫度保持一致，稀釋比例應根據精液的品質作1～3倍稀釋。

4.2.2 稀釋后的精液經20～30 min緩慢降溫，至2℃左右平衡2～3h，再加入等溫Ⅱ液，加入量為第一次稀釋比例的一半。第二次稀釋前應對精液進行鏡檢，活力過低者廢棄，如活力下降需根據情況降低稀釋倍數。

5 精液平衡

將稀釋后的精液放在4℃陳列柜中平衡，等溫度降到4℃以下再分裝。

6 分裝

分裝前將精液上下輕輕顛倒幾次，以保證精液密度、活力均勻。分裝時使用0.25mL細管，通過人工吸取或使用注射器將稀釋后的精液注入細管，并用聚乙烯醇粉快速密封管口，然后將細管均勻置于冷凍支架上。精液裝管時需保證細管內有1.5cm的空氣，以防冷凍后爆管。

7 精液冷凍

將液氮倒入有蓋的平底器皿中（本實驗使用泡沫盒），再放入冷凍支架，距離液氮面3 cm，并保證支架的水平溫度在-155～-165℃之間，熏蒸8～10min，冷凍后裝入液氮罐。

8 總結

本次成都麻羊凍精制作總耗時5個月，制作周期為每周兩次。采集12只種公羊的精液，共包含八個血緣。公羊采精量平均為0.91mL，鮮精活力平均值為0.63，總共制作了3104支細管凍精。每支細管凍精精液量均在0.2mL以上，解凍活力均在0.3以上，前進運動精子數均在3000萬以上，符合國家標準，效果良好。

通過本次凍精制作，我們發現凍精質量與操作過程中的各個環節緊密相連，對溫度和時間的掌控尤為重要。在精液檢測環節，一定要注意加強對恒溫載物臺的使用，使用的載玻片、蓋玻片等需要提前放置在恒溫載物臺上預熱。平衡環節一定要緩慢降溫，切忌降溫過快對精液造成冷打擊，影響精液質量。