miRNAs對肝星狀細胞生物學功能調控機制的研究進展

梅怡晗，陳星，陳芳，喻雪琴，戢敏，梅小平

(1首都醫科大學，北京1000069;2川北醫學院附屬醫院)

肝纖維化(HF)是各種病因所致的慢性肝細胞損傷后持續發展的共同病理特征，是肝組織反復創傷與修復的炎性反應以及肝組織細胞外基質過度沉積的結果，是慢性肝病向肝硬化發展的必經階段[1]。肝組織受損后, 在由各種炎性介質誘導的多信號轉導通路介導下, 處于靜息狀態的肝星狀細胞(HSC)被激活、增殖, 致肝細胞間基質(ECM)大量沉積，是導致肝纖維化、肝硬化發生的中心環節之一。目前臨床上尚缺乏有效逆轉或阻止HF進展的治療藥物。HSC是肝細胞外基質的主要來源，是正常肝組織和纖維化肝組織ECM的主要來源。肝組織受損后, 在由各種炎性介質誘導的多信號轉導通路介導下, 處于靜息狀態的HSC被激活、增殖, 由靜止型HSC轉化為活化型HSC，分泌ECM在肝組織內大量沉積，是導致肝纖維化、肝硬化發生、發展的關鍵環節之一[2]。深入研究HSC的生物學行為、細胞外調控機制、信號轉導通路、基因組學及免疫學調控等不同調控機制，有助于HF的診斷與治療，以抑制HSC激活、增殖及促進HSC凋亡為靶點的治療HF的研究方法已成為目前的研究熱點。微小RNA( miRNA)是一種由19～22個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈小分子RNA，可與靶miRNAs全部或部分靶向結合后誘導miRNAs降解或轉錄抑制，對轉錄后的基因進行調控[3～6]。部分miRNAs在肝組織內表達，在肝臟疾病的發生、發展、預后和轉歸中發揮重要作用[7]。研究[8]發現，miRNAs可通過調控HSC生物活性功能來發揮對HF發生、發展的調控作用。存在于體內的miRNA能在轉錄與抑制基因表達方面起到重要的調控作用，特別是對HSC的激活、增殖或凋亡的特異性調控對肝組織纖維化的發生起到了重要的調節作用，為此可能對肝纖維化的分子靶向治療提供新路徑與理論依據。現將miRNAs在HSC生物學活性調控中的作用機制綜述如下，旨在為HF的治療提供新路徑。

1 miRNAs在HSC激活中的作用機制

HSC是一種竇周細胞，位于肝細胞與肝竇內皮細胞之間的間隙，即Disse內，胞體呈星狀分布的長突，包繞肝細胞與肝血竇[9]。正常肝組織中HSC主要以富含VitA脂滴的靜止型細胞存在，其增殖活性與膠原纖維合成能力均較低。其生理功能包括：ECM的合成與降解；細胞因子及受體的表達；肝竇血流量的調節等[10]。

HSC的激活是指在各種致炎因子作用下，將靜息的、富含維生素A的細胞活化為致纖維化的肌成纖維化細胞，誘發并獲得收縮纖維以及細胞增殖[11]。活化的HSC大量增殖后導致以膠原纖維為主的ECM分泌增多，并高表達具有收縮功能的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)水平，α-SMA的表達是HSC激活與活化的標志。HSC的活化包括HSC的活化啟動與持續兩個階段。啟動階段是指基因表達與表型改變，使靶細胞對刺激因子發生反應的過程。持續階段是這些刺激所產生的反應不斷維持活化表型與促進纖維化的效應[12]。慢性肝病或肝組織纖維化過程中靜止型HSC可轉化為活化型HSC。活化型HSC參與并調節維生素A的代謝，為肝細胞儲存能量；誘導機體產生基質金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶抑制物(TIMP)，參與肝組織ECM生成、降解或膠原纖維產生[13]，導致肝纖維化的形成。

HSC的激活與否是肝組織發生纖維化的中心環節。Chen等[14]研究發現，目前有17個miRNAs在高表達時可促進HSC的激活，同時有14個miRNAs在低表達時可促進HSC的激活。Venugopal 等[15]研究結果顯示，miR-150、miR-194在激活的HSC 中低表達，表明miR-150、miR-194可抑制轉錄調節因子c-myb和rac-1表達，抑制HSC的激活，進一步降低ECM 的表達。Li 等[16]研究結果顯示，HF模型大鼠活化型HSC中miR-34a/c高表達，而低表達的miR-34a /c能使活化型HSC轉化為靜息型HSC，miR-34a /c可能與抑制其靶基因過氧化物酶體增殖物激活受體α相關。

我們前期研究發現，大鼠肝纖維化模型活化HSC中miR-122、miRNA -150均呈低表達，這可能與miR-122、miRNA -150可抑制c-myb和rac1表達，進而抑制HSC活化；本研究同時發現，活化HSC中存在miR-221 、miR-222高表達，其高表達可能調控了HSC 激活的相關基因表達，誘導了HF的發生。促進miR-122和miRNA -150表達或抑制miR-221 、miR-222表達可抑制肝組織纖維化的發生發展。在體外細胞培養中發現，miR-221 、miR-222能促進HSC中Ⅰ型膠原的表達，進一步猜測miR-222可能激活NF-κB信號通路，來調控炎癥反應。

TGF-β/Smad、p38MAPK、Wnt/β-catenin和P13K/Akt 等是調控肝組織纖維化發生發展的主要信號通路。其中TGF-β是參與HSC激活、增殖與凋亡作用的最主要的細胞因子之一，是調控肝組織纖維化發生的最主要的信號通路。TGF-β/Smad可抑制HSC的增殖與活化，導致ECM在肝細胞間的過度沉積而發生肝纖維化。HSC中miR-200高表達時可抑制其靶基因Keap1的表達，促進Nrf2的核遷移與激活，抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，進而阻斷肝纖維化的發生[17]；miR-200a高表達可抑制TGF-β對HSC的活化、增殖，降低Smad4的表達；抑制HF。Li等[16]研究發現，miR-33a對 PI3K/Akt 信號通路的活化具有調控作用，調控miR-33a的表達水平對PI3K/Akt 信號通路具有明顯的調節作用。miR-214對PI3K/Akt信號通路具有明顯的負性調節作用，進而誘導、促進了肝纖維化的發生。Sun等[18]研究發現，Wnt /β-catenin信號通路是miR-200a的下游靶基因和信號通路，miR-200a可通過調控Wnt/β-catenin信號通路來對肝纖維化發生的抑制作用，延緩或阻止肝纖維化進程。

轉化生長因子β1(TGF-β1)是激活HSC的最強細胞因子，它可通過調控TGF-β1/Smad信號通路來激活HSC。研究[19]發現，miR-19b可通過靶向調控TGF-β1RⅡ/Smad3 的表達水平來降低Ⅰ、Ⅱ等前膠原的表達，進而調控肝組織纖維化的發生與發展。miRNAs通過調控細胞外調節蛋白激酶/細胞外信號調節激酶-1(Raf/ERK1)、肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活因子(JAK/STAT)、第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白/肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶(PTEN/PI3K/AKT)等信號轉導通路，促進HSC的激活。Wang等[20]研究發現，miR-29b通過與PI3KR1/AKT3的3′-UTR的結合來發揮抑制HSC的激活。Wei等[21]研究發現，miR-21高表達可激活HSC，miR-21m低表達可通過降低PTEN蛋白表達水平來抑制HSC的激活。對PI3K具有抑制作用的LY294002可抑制AKT信號通路的活化，抑制HSC的活化，進而抑制肝組織纖維化的發生。Zhang等[22]研究發現，miR-21可通過對SPRY2和HNF4α的3，-UTR的直接靶向作用來發揮負性調節作用，導致EKI1信號通路的激活，進而誘導HSC的激活來促進肝組織纖維化的發生、發展。

2 miRNAs在HSC增殖中的作用機制

有學者[23]研究發現，miR-19b、miR-150、miR-194、miR-146a、miR-29等可抑制HSC的增殖, 特別是miR-200a的失衡與肝組織纖維化中ECM的異常表達密切相關。Sun等[18]研究發現，用CCl4誘導大鼠發生肝組織纖維化，大鼠肝組織miR-200a呈低表達；HSC的增殖率明顯升高，上調miR-200a的表達可降低TGF-β2的表達, 抑制TGF-β和Wnt/β-catenin信號通路的激活, 抑制HSC的增殖，發揮抗纖維化的作用；miR-200a可通過靶向調控胞質蛋白伴侶分子/核因子E2相關因子(Keap1 /Nrf2)信號通路來抑制HSC增殖。He等[24]研究發現，轉化生長因子-1(TGF-1)誘導的HSC活化、增殖過程中存在miR-146表達降低；轉染miR-146至激活的HSC中會抑制HSC的增殖。Sekiya 等[25]研究發現，在原代培養大鼠HSC的增殖過程中存在miR-195低表達，進一步分析認為miR-195能延遲HSC的G1期向S期發育來抑制HSC的增殖。miR-17-5p 可通過靶向調控Smad7來促進HSC的增殖而誘導肝組織纖維化的發生、發展[26]。

TGF-β1及相關膜受體結合并活化后，可招募、活化相同受體的下游Smad家族蛋白，miRNAs可通過對TGF-β1/Smad信號通路的調控，促進HSC增殖。在大鼠肝HSC自發活化過程中，HF組織中miR-9表達升高，且其表達水平與肝組織纖維化程度呈正相關，HF組織中miR-150表達降低，提示miR-150可抑制HSC的增殖。

研究[27～29]發現，在TGF-β1誘導活化的HSC中miR-17表達升高，靶向調控Smad7表達，進而誘導、促進HSC增殖。相反，TGF-β1誘導活化的HSC中miR-146表達降低，抑制miR-146表后活化型HSC數量減少，HSC的增殖能力與數量下降，α-SMA表達降低，表明miR-146、miR-17表達變化可通過影響Smad7表達調控HSC的增殖。

3 miRNAs在HSC凋亡中的作用機制

促進HF的發生與逆轉的關鍵在于促進HSC凋亡，HSC大量凋亡后活化的HSC數量顯著降低，ECM分泌減少，HF可自發性逆轉。王慧利等[27,30]研究發現，將miR-15b、miR-16轉染到活化的HSC后發現，線粒體相關抗凋亡蛋白(Bcl-2)表達減少，miR-15b、miR-16 可降低Bcl-2的表達，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，促進HSC的凋亡；進一步將PLV-miR-16轉染到活化型HSC后發現，細胞的代謝周期發生紊亂并受到抑制，細胞凋亡增加，并發現miR-16能降低細胞周期蛋白D1的表達，從而抑制細胞增殖，促進激活后的HSC凋亡。Sekiya等[25]研究結果顯示，miR-195高表達可促進其與細胞周期蛋白3′-UTR的結合，抑制細胞周期 G1/S期轉化，從而抑制HSC的活化與增殖，促進HSC的凋亡。Wang等[20]研究發現，miR-29能使細胞周期蛋白D1和p21cip1的表達水平下調，阻滯HSC的代謝周期G1期向S期發育，誘導Caspase和PARP凋亡基因水平高表達，促進HSC凋亡。miR-21可通過抑制其靶基因PTEN的表達，抑制HSC的活化，促進HSC的凋亡，抑制ECM的產生與沉積[19]。

HSC活化過程中共10種miRNAs表達升高，9種miRNAs表達降低。進一步研究發現，促纖維化細胞因子血小板衍生生長因子BB可誘導促進miR-21表達，抑制靶基因PTEN表達，誘導AKT 激酶活化，促進HSC由靜止型轉化為活化型。miR-15b、miR-16表達改變可通過抑制Bcl-2表達，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9來誘導、促進HSC凋亡。miR-21是HSC的調控機制中PTEN信號通路的靶基因，對AKT 激酶發揮抑制作用，能抑制HSC活化、誘導HSC凋亡。

綜上所述，miRNAs通過調控HSC的活化、增殖以及凋亡，參與HF的發生發展。miRNAs可直接或通過TGF-β1/Smad、Raf/ERK1、PI3K/AKT、JAK/STAT、PTEN/PI3K/AKT等信號轉導通路促進HSC的激活。miR-19b、miR-150、miR-194、miR-146a、miR-29等可抑制HSC的增殖。miR-9、miR-150、miR-146、miR-17等可通過調控TGF-β1/Smad信號通路，調控HSC的增殖。miRNAs可抑制Bcl-2、細胞周期蛋白D1表達，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，促進HSC凋亡。