G0S2基因在食管癌組織中表達變化及對癌細胞增殖、凋亡的影響

祝鋮，李蓮，唐俊明，張蕾，鄭飛

(湖北醫藥學院附屬人民醫院，湖北十堰442000)

G0S2基因最早發現于血液單核細胞[1]。早期研究認為，G0S2基因在調節細胞周期及細胞增殖方面有重要作用[2]。研究發現，G0S2基因能夠與其他蛋白相結合來發揮自身生物學效應，如通過結合B淋巴細胞瘤-2基因促進腫瘤細胞凋亡[3]。G0S2基因可能具有抗癌作用，但尚未得到驗證。食管癌組織中存在G0S2基因甲基化現象，其因甲基化而沉默[4]，提示G0S2基因消除甲基化恢復表達可能成為治療食管癌的新途徑。本研究觀察食管癌組織中G0S2基因的表達情況，并觀察G0S2基因高表達對食管癌細胞增殖和凋亡的影響，為防控食管癌提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料來源 2016年3月～2017年4月本院手術切除的45例份食管癌組織(患者男40例、女5例，年齡47～70歲、中位年齡59歲，術前均未行放化療)及其相應的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，均經病理檢查證實，于液氮中凍存。TRIzol試劑、DEPC水購于美國Sigma公司；RNA逆轉錄試劑盒購于美國賽默飛公司；RT-PCR上、下游引物及GAPDH引物均購于武漢金開瑞生物工程公司；瓊脂糖粉購于Lonza公司；食管癌KYSE-70細胞購于中國科學院上海細胞所；G0S2腺病毒裂解液與空載體由本院臨床醫學研究所提供；甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷試劑購于Sigma公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰酶等均購于美國Gibco公司。

1.2 食管癌及癌旁正常組織中G0S2基因表達檢測 采用qRT-PCR法。按照TRIzol試劑說明書提取組織RNA，根據RNA逆轉錄試劑盒說明書對已提取的RNA進行逆轉錄。G0S2行qRT-PCR擴增，上游引物：5′GGCCTGATGGAGACTGTGTG3′、下游引物：5′CTTGCTTCTGGAGAGCCTGT3′，全長115 bp。GAPDH上游引物：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′。qRT-PCR反應體系10 μL,反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸32 s，共40個循環。讀取各樣本Ct值，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.3 KYSE-70細胞培養及處理 用含10%胎牛血清的RPM 1640培養基培養KYSE-70細胞，置于37 ℃、5% CO2、濕度適宜的培養箱中。待細胞長至70%～80%時，隨機分為空白組、Ad-Null組、Ad-G0S2組及0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組。Ad-Null組、Ad-G0S2組分別轉染Ad-G0S2、Ad-Null，0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組分別給予0、25、50、100 μmol/L濃度的甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷進行處理。將各組細胞繼續培養24 h。用 qRT-PCR技術檢測各組G0S2mRNA表達，方法同1.2。轉染后及經5-氮雜-2-脫氧胞苷處理后細胞內G0S2mRNA相對表達量升高，說明實驗成功。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。收集各組細胞接種于96孔板，每孔1.0×104/mL，每組設置5個復孔。培養結束后向每孔滴加CCK-8試劑10 μL，孵育2 h。用酶標儀測定450 nm波長下各個孔的吸光度值。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。取各組細胞用4 ℃預冷無菌PBS洗滌2次，并用0.25%的胰酶(含0.02%EDTA)消化離心，用Binding Buffer 200 μL重懸細胞，調整細胞為(2～5)×105/mL，取細胞懸液195 μL，加入Annexin V-FITC 5 μL，輕輕混勻后間隔3 min再加入PI 10 μL，混勻，室溫避光孵育10 min。在反應管中加入無菌PBS 300 μL，混勻。上機檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1 G0S2基因在食管癌組織和癌旁組織中的表達比較 G0S2基因在食管癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為31.9±7.8、1，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 G0S2對KYSE-70細胞增殖的影響 空白組、Ad-Null組、Ad-G0S2組及0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組吸光度值分別為0.99±0.05、0.91±0.12、0.56±0.17、0.87±0.08、0.75±0.03、0.68±0.06、0.60±0.02。Ad-G0S2組吸光度較其他兩組低(P均<0.05)，空白組與Ad-Null組吸光度值比較差異無統計學意義(P>0.05)；隨5-氮雜-2-脫氧胞苷濃度升高，吸光度值逐漸降低，細胞增殖活力下降(P均<0.05)。

2.3 G0S2對食管癌KYSE-70細胞凋亡的影響 空白組、Ad-Null組、Ad-G0S2組及0、25、50、100 μmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷組細胞凋亡率分別為3.2%±2.8%、3.6%±2.1%、12.1%±1.8%、1.3%±0.4%、4.1%±1.7%、7.3%±1.9%、9.5%±1.1%。Ad-G0S2組細胞凋亡率較其他兩組高(P<0.01)，空白組與Ad-Null組凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)；隨5-氮雜-2-脫氧胞苷濃度升高，細胞凋亡率升高(P<0.05)。

3 討論

研究表明，G0S2基因能調節細胞增殖分化，促進癌細胞凋亡，抑制腫瘤發生發展等；調節細胞由G0期向G1期轉化，細胞進入G1期后誘導G0S2基因瞬時表達，G0S2反過來抑制細胞由G0期進入G1期，從而能使細胞穩定增殖和分化[5]。細胞只有正常地表達G0S2基因，才能夠正常、穩定地進入細胞分化的過程[6]。最近有研究指出，接受造血干細胞移植的患者，其外周血單核細胞中的G0S2基因表達明顯上調[7]。研究發現，膠質瘤患者中癌細胞G0S2基因低表達，與膠質瘤細胞的發生發展密切相關[8]。以上說明G0S2基因對細胞增殖有重要的穩定和調控作用。抑癌基因失活是癌癥發生的重要因素之一[9]，而抑癌基因的啟動子區發生甲基化是其失活的重要環節[10]。癌組織與正常組織中的G0S2基因甲基化程度存在明顯差異，因此G0S2基因的表達水平亦存在明顯差異[11]。近年來研究發現，G0S2基因的啟動子區因發生高甲基化而沉默，呈低表達，從而導致癌癥的發生，在頭頸部癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥中均已被發現并證實[12]。最近在皮膚鱗癌組織中也發現G0S2基因因甲基化而沉默的現象[13]。研究發現，人慢性髓系白血病細胞的G0S2基因調控序列和外顯子區因處于高甲基化的狀態而沉默，使用特定的去甲基化試劑后發現，細胞增殖活性降低[14]；相反利用特定技術使G0S2基因沉默，則促進癌細胞增殖。有研究用shRNA使大腸癌細胞的G0S2基因沉默，發現大腸癌細胞增殖活力明顯提高[15]。由此可見，一方面甲基化現象在癌癥中廣泛存在，如何消除甲基化使G0S2基因正常、穩定地表達從而發揮抑癌作用，是癌癥高效治療的關鍵所在。另一方面說明G0S2基因高表達治療食管癌具有一定的理論依據；且食管癌的傳統治療方案效果欠佳，食管癌患者5年生存率較低，生活質量差。目前對G0S2基因在食管癌治療中作用的研究較少，以此為研究方向可能成為食管癌高效治療的突破口。本研究結果顯示，食管癌組織中G0S2基因呈低表達，證明食管癌的發生可能與G0S2基因低表達有密切關系；通過轉染及甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷使G0S2基因過表達后兩種方法，G0S2基因能夠抑制食管癌KYSE-70細胞的增殖，促進其凋亡。

G0S2基因正常表達是抑制食管癌細胞增殖、促進其凋亡的重要因素；如何消除甲基化從而使G0S2基因正常、穩定地表達可能是預防和治療食管癌的研究熱點。G0S2基因的甲基化修飾及其在食管癌發生、發展中如何發揮作用有待進一步的研究。

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