DKK1基因過表達慢病毒載體構建及其在大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12中的表達

李慧華，仝書嚴，陳銳，張才溢，耿德勤

(徐州醫科大學，江蘇徐州221004)

Dickkop-1(DKK1)是DKK蛋白家族成員之一。DKK1基因是經典Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑。DKK1基因可參與誘導頭部的產生，在胚胎發育、神經再生、突觸形成等體內多種病理生理過程中發揮作用[1，2]。研究發現，機體內DKK1基因表達異常，可引起認知障礙、情緒異常等神經精神疾病[3，4]。近年尸檢發現阿爾茨海默病(AD)患者腦組織DKK1基因表達增加。小鼠海馬組織DKK1表達隨年齡增加而增加，并伴有空間工作記憶障礙。DKK1基因在AD中的作用引起了越來越多的關注[5，6]。此外，DKK1基因還在腫瘤及腎臟、肝臟、骨疾病中發揮重要作用[7，8]。大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞作為類神經元細胞，在結構、功能上與神經元有很多相似之處，但較神經元容易培養，常用于神經精神系統疾病的體外研究[9]。2016年6月～2017年6月，本研究選用PC12細胞為研究對象，建立穩定細胞系，為進一步探討DKK1基因在神經精神疾病中的作用及分子生物學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 目的基因DKK1 (NM_001106350)、慢病毒載體質粒GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)、慢病毒包裝質粒pHelper1.0、pHelper2.0和E.coli DH5α感受態細菌、293T細胞(上海吉凱基因化學技術有限公司)；PC12細胞為本實驗室保存。RPMI1640培養基(Cyclone)，胎牛血清(Gemini)，嘌呤霉素(Selleck)，蛋白裂解液 (上海吉凱基因化學技術有限公司)，DKK1抗體(Abcam)，β-actin抗體(Santa Cruz)，限制性內切酶AgeI(NEB)、Taq DNA聚合酶(SinoBio)，dNTP(Takara)，Primer(捷瑞生物)，In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech)，質粒抽提試劑盒(Promega)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化)，Lipofectmine 2000(invitrogen)，SYBR?qPCR Mix(Roche)。

1.2 DKK1基因擴增 采用RT-PCR法。參考GenBank中DKK1的cDNA編碼序列(NM_001106350)，使用Primer5軟件設計引物，交由上海吉凱基因化學技術有限公司合成引物序列。DKK1基因上游引物序列：5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACGGTTGTGCGTGCAGTGGCAG-3′，下游引物序列：5′-TCCTTGTAGTCCATACCGTGTCTCTGGCAGGTGTGGAGCCTG-3′(在上下游引物5端分別加入限制性內切酶AgeI/AgeI酶切位點及保護堿基)。以含有DKK1基因的cDNA庫為模板，擴增DKK1基因序列。PCR反應體系：98 ℃預變性5 min、98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃保溫8 min，4 ℃保存。PCR產物大小854 bp。擴增產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收RT-PCR產物。

1.3 DKK1基因慢病毒表達載體的構建與鑒定 用限制性內切酶AgeI/AgeI對GV358載體進行酶切，使其線性化。瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物。將線性化的GV358載體DNA和DKK1基因酶切產物進行連接反應，于冰水浴中配制如下反應體系：ddH2O 2.5 μL，5×CE Ⅱ Buffer 2 μL，酶切后的載體DNA 2.5 μL，純化后的PCR產物片段2 μL，ExnaseTMⅡ 1 μL；于37 ℃反應30 min，隨后置于冰水浴中冷卻5 min后立即轉化至大腸桿菌DH5a感受態細菌。將細菌接種于含有氨芐青霉素的平板上，在恒溫培養箱中倒置培養12～16 h。挑取重組陽性克隆行PCR初步鑒定后及送測序。PCR鑒定上游引物：5′-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3′，下游引物：5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′，產物1 005 bp。反應體系包括：ddH2O 9.2 μL，2× Taq Plus Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，單個菌落，總體積20 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，72 ℃延伸5 min，保存。采用空載體質粒為陰性對照組，有GAPDH的載體為陽性對照組，排除假陰性和假陽性結果。對PCR陽性克隆片段進行測序。

1.4 重組慢病毒的包裝及滴度測定 GV358-DKK1基因慢病毒載體系統包裝：取對數生長期的293T細胞，調整細胞密度為5×106/mL，胰酶消化后接種于直徑10 cm細胞培養皿中，37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h，細胞長至70%～80%融合時進行轉染。將GV358-DKK1質粒和兩種病毒包裝輔助質粒pHelper1.0、pHelper2.0分別進行高純度無內毒素質粒抽提，采用Lipofectamine2000脂質體介導的瞬時轉染法進行共轉染，包裝293T細胞。培養6 h后更換為完全培養基，繼續培養48 h收集上清，離心去除細胞碎片；0.45 μm濾器過濾，超速離心濃縮后收集病毒濃縮液，-80 ℃保存。將293T細胞按4×104/孔接種96孔板，分別加入逐孔稀釋法稀釋的病毒液，48 h后觀察熒光表達情況，估計慢病毒轉染目的細胞的效率。同時設立空載體對照組。收取細胞抽取基因組DNA并做定量PCR檢測，計算滴度，公式：qPCR滴度=N×C/V。N為感染時24孔板中對應孔的細胞數量，C(每個細胞中含有的慢病毒個數)=(A拷貝數/B拷貝數)×2，V為對應孔中感染的慢病毒體積。

1.5 PC12細胞感染及穩轉細胞株篩選 PC12細胞培養于含10% FBS的1640培養基中，取對數生長期的PC12細胞接種于6孔板中，第2天細胞密度50%左右進行病毒感染。將細胞隨機分為三組，空白對照組、空載體陰性對照組、PC12-DKK1組，空載體陰性對照組、PC12-DKK1組分別用制備的空載體慢病毒(GV358-Vector)及GV358-DKK1顆粒進行感染，24 h后更換為正常培養基繼續培養；空白對照組常規培養。經嘌呤霉素(終濃度1.5 μg/mL)篩選2周后獲得穩定感染的細胞株。

1.6 PC12細胞中DKK1 mRNA表達檢測 采用qRT-RCR技術。收集三組細胞，分別加入TRIzol等提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度；RNA逆轉錄獲得cDNA，再以適量cDNA為模板進行PCR擴增。內參GAPDH引物序列：上游5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCA-3′、下游5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′；DKK1引物序列上游5′-TTGACAACTACCAGCCCTACCC-3′、下游5′-CTCGAGGTAAATGGCTGTGGTC-3′。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.7 PC12細胞內DKK1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集三組細胞，用細胞裂解液進行裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，計算上樣量，配制10% SDS-PAGE凝膠，常規電泳、轉膜、封閉，隨后分別用一抗DKK1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗2 h，Odyssey雙色紅外激光成像系統進行條帶掃描。采用Image J軟件分析條帶灰度值，用DKK1灰度值比內參灰度值作為DKK1蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 GV358-DKK1慢病毒載體的構建結果 用設計的DKK1引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見大小約為854 bp的特異性條帶。抗生素篩選菌落，PCR對重組子進行鑒定，擴增出大小為1 005 bp的陽性克隆片段，對陽性克隆菌進行測序，測序結果與目標序列完全一致。證明GV358-DKK1慢病毒載體構建成功。

2.2 慢病毒包裝及病毒滴度測定結果 三質粒(GV358-DKK1/GV358-vector、Helper1.0、Helper2.0)共同轉染293T細胞48 h后熒光顯微鏡下見大量綠色熒光，約95%以上且熒光強度高，293T細胞生長狀態好，表明慢病毒包裝成功且轉染效率高。收集、濃縮病毒后逐孔稀釋滴度測定法測定GV358-vector和GV358-DKK1的滴度分別為6×108、2×108TU/mL。

2.3 PC12細胞慢病毒感染結果 慢病毒感染PC12細胞72 h后可見少許熒光。用嘌呤霉素連續篩選2周后，熒光顯微鏡下所有細胞可見綠色熒光，感染效率大于95%。

2.4 感染后各組細胞內DKK1 mRNA及蛋白表達比較 空白對照組、空載體陰性對照組、PC12-DKK1組細胞DKK1 mRNA相對表達量分別為1.02±0.27、0.97±0.24、133.74±0.93，DKK1蛋白相對表達量分別為1.02±0.14、1.06±0.12、1.48±0.21。PC12-DKK1組DKK1 mRNA及蛋白相對表達量均較空載體陰性對照組和空白對照組高(P均<0.05)。

3 討論

DKK家族由4個成員(DDK-1、DDK-2、DDK-3、DDK-4)組成[10，11]。1998年，Glinka等首次在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎頭部發育的誘導機制中發現、克隆并定義了DKK1及其家族。DKK1是DKK家族中被研究最多的成員。研究發現，人類DKK1基因位于10號染色體10q11，約3.5 kb，由266個氨基酸組成的分泌型糖蛋白[12]。DKK1結構包含兩個保守的半胱氨酸區域，輔脂肪酶折疊區域可與膜受體LRP5/6及另一類穿膜蛋白Kremen1/2結合形成三聚體、內吞，阻斷Wnt-Frizzled-LRP5/6復合物形成，進而促進胞內信號分子β-catenin磷酸化，使其泛素化，在胞質內被水解，阻斷β-catenin進入細胞核與轉錄因子TCF、LCF結合，起到負性調節Wnt信號通路的作用[13]。Wnt信號通路在神經發生、神經可塑性中起重要作用，并且與記憶學習功能關系密切，Wnt通路的異常可能是認知損傷的潛在發生機制[14，15]。研究發現，DKK1基因可能作為各種刺激誘導細胞凋亡的重要介質，參與該機制的調控[16]。DKK1基因啟動子包含1個p53應答元件，誘導DKK1基因的表達[17]。此外，紫外線和化學治療劑引起的基因毒性增強了DKK1基因表達，DKK1基因使神經膠質瘤細胞對神經酰胺誘導的細胞凋亡敏感。本課題組前期亦發現DKK1基因可降低PC12細胞活性、促進PC12細胞凋亡[18]。目前未見類似DKK1過表達重組慢病毒轉染PC12細胞的研究報道。

近期研究發現，DKK1基因與許多中樞神經系統疾病的神經退化有關，包括AD、腦缺血和顳葉癲癇等。在細胞和動物的興奮毒性、β淀粉樣毒性、短暫性腦缺血和誘發癲癇的動物模型中DKK1基因的產生早于神經元退化[19]。隨著人們對DKK1基因在神經精神疾病中所起作用認識的深入，以DKK1基因為靶點的機制研究不斷增加。使用慢病毒作為載體可以提高病毒轉染效率，具有獲得病毒周期短、滴度高的優點，實現了在細胞中長期穩定表達。本實驗通過三質粒系統構建高表達GV358-DKK1的慢病毒載體，用適當濃度病毒液感染PC12細胞，嘌呤霉素連篩2周后熒光顯微鏡下均見綠色熒光，說明GV358-DKK1成功感染PC12細胞。隨后證實DKK1 mRNA及蛋白相對表達量均提高，進一步說明本實驗成功獲得DKK1基因高表達PC12細胞株。為后續探討DKK1基因的功能、特性及在神經精神疾病中的作用提供理想的細胞模型。

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