丁酸梭菌的研究與應用

唐 昊，韓奇鵬，張佩華

（ 湖南農業大學 動物科學技術學院，長沙 410128）

1933年日本千葉醫科大學宮入近治博士發現丁酸梭菌，又被稱為宮入菌、酪酸菌、丁酸梭狀芽孢桿菌和酪酸梭菌，是梭菌屬、芽孢桿菌科嚴格厭氧的革蘭氏陽性厭氧細菌，可產生一種丁酸，并在培養過濾物中含有少量脂肪酸[1]。具有抑制沙門氏菌、大腸桿菌等致病菌和促進腸道乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌生長的整腸作用。

1 丁酸梭菌特征

丁酸梭菌常被發現于健康動物糞便、土壤、自然酸奶和干酪中[2]。菌體一般單個或成對存在，體呈稍彎曲或直桿狀，寬0.6～1.2 μm，長3.0～7.0 μm，兩段鈍圓；芽孢呈橢圓形或圓形，孢子呈次端生或偏心，無孢附屬絲和外壁，細胞壁含D、L-二氨基庚二酸和葡萄糖，周身鞭毛，可運動，偶見絲狀菌體。菌落表面形態直徑1～3 mm，呈稍不規則的圓形，菌落成奶油色或白色。丁酸梭菌能夠促進多種碳水化合物發酵生成乙酸、丁酸、淀粉酶、丁醇、維生素和脂肪酶等，并產生大量氫氣，菌株廣泛用于產氫能源領域。最適生長繁殖溫度為25～37℃，可合成自身生長所需的維生素和氨基酸[3]。

2 丁酸梭菌生理功能

2.1 營養作用

丁酸梭菌可產生良好的動物所需的營養素來源或具有輔助消化作用的丁酸、消化酶、氨基酸、B族維生素等營養物質。丁酸梭菌產生輔助動物消化飼料日糧的胞外酶主要有蛋白酶和淀粉酶等，并分泌大量的胞內酶。同時，丁酸梭菌和拜仁梭菌混合可產生果膠裂解酶和果膠甲酯酶，在腸道產生的果膠最終分解為SCFA[4]。丁酸梭菌代謝中產生的VB1、VB2、泛酸和煙酸等，為動物代謝和生長發育提供必需的營養物質，像維生素K和B族維生素不但可以提供營養，還可促進維生素E的吸收。研究表明，丁酸梭菌在37℃厭氧條件下培養24 h后，上清液中葉酸濃度可以達到8.0 mmol·L-1，維生素B12含量為93 pg·mL-1和維生素B2含量可達111.0 ng·mL-1[5]。

2.2 維持腸道菌群平衡

作為調整腸道功能的代表性菌之一的丁酸梭菌，具有促進有益菌定植和繁殖及抑制有害菌生長的特點。丁酸梭菌產生的脂肪酸（乙酸、丁酸）有降低腸道內pH，抑制有害菌附著與繁殖的功能。

有研究將丁酸梭菌分別按不同比例體外混合培養于有益菌雙歧桿菌、乳酸桿菌和有害菌雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌中，結果表明，丁酸梭菌可增強雙歧桿菌和乳酸桿菌的繁殖，并一定程度抑制雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌[6]。

同時，張達榮等采用丁酸梭菌制劑服用于有腹瀉、便秘癥狀的患者，結果表明，丁酸梭菌可促進乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的增殖，并抑制腸道內病原菌和腐敗菌[7]。

丁酸梭菌調節動物腸道微生態環境的可能機制總結為4點。丁酸梭菌在動物腸道內有競爭營養物質的作用，一定程度抑制有害菌的生長繁殖，并占據腸上皮細胞黏附位點，進而抑制致病微生物黏附生長；丁酸梭菌可分泌分解多聚糖的多糖分解酶，促使腸道有益菌的發酵底物增多，進而促進機體生長、繁殖；短鏈脂肪酸（SCFA）的大量產生，可促進腸道黏膜修復、腸道pH降低及抑制有害菌生長，并分泌細菌素可以抑制致病菌蛋白質和核酸的合成、降低ATP濃度，促使細胞內K+外流，進而抑制有害菌定植生長；丁酸梭菌可促使細胞壁上的脂磷壁酸可抑制大腸桿菌在腸上皮細胞的黏附作用[8-12]。

2.3 促進生長

丁酸梭菌生長過程中能分泌蛋白酶、果膠酶、淀粉酶、纖維素酶和糖苷酶等多種酶類。研究表明，高產淀粉酶的丁酸梭菌菌株可以在雞表面粘液中分離得到[8]。分離純化定植在動物腸道內的丁酸梭菌可產生果膠甲酯酶和魔芋葡甘露聚糖降解酶[13]。而產維生素酶的丁酸梭菌菌株可在土壤腐木和動物糞便的混合物中篩選分離出來[14]。丁酸梭菌產生酶類有助機體對碳水化合物等營養物質的消化吸收，進而促進機體生長。丁酸梭菌飼喂1日齡羅斯肉雞42 d，發現丁酸梭菌比抗生素更能明顯提高肉雞重量[15]。此外，丁酸梭菌代謝產物丁酸等能修復腸道及促進腸道上皮細胞再生，其合成的各種維生素能維持人體健康。

2.4 免疫功能及抗氧化性

丁酸梭菌可激活機體免疫系統，促使機體免疫力增強，進而維持動物健康。丁酸梭菌的抗炎作用主要是通過激活動物腸道上皮細胞的TLR-2，從而調節NF-κB信號途徑分泌促炎因子（TNF-α、IL-6），進而降低機體致病菌的感染。丁酸梭菌喂給肉雞后，肉雞血清總蛋白和免疫球蛋白IgM含量都顯著提升[15]。同時，丁酸梭菌飼喂仔公雞，可使仔公雞的免疫球蛋白含量、IgG蛋白含量、間胸腺指、脾臟指數和血清補體3含量均有一定程度的增加[16]。此外，無菌小鼠口服丁酸梭菌后發現，腸道內IgA蛋白含量升高，但丁酸梭菌滅活后飼喂小鼠，腸道內IgA蛋白含量沒有增加，進一步試驗表明丁酸梭菌可以使小鼠體內多細胞黏膜免疫系統激活[17]。

研究表明，丁酸梭菌滅活后，可激活小鼠巨噬細胞和自然殺傷細胞的細胞毒性，且通過誘導產生高滴度的IFN-γ，進而提高小鼠機體免疫功能[18]。同時發現，丁酸梭菌可促進無菌小鼠的腸道免疫和增強抗霍亂毒素的活性[17]。丁酸梭菌可介導體液免疫途徑，促使鲇魚血清和皮膚的溶解酶活性和免疫球蛋白水平增強及血清酚氧化酶和酸性磷酸酶活性[19]。此外，雙糞腸球菌可與丁酸梭菌聯合使用，增加腹瀉兒童的血清抑炎因子IL-10含量，降低促炎因子TNF-α水平[20]。

2.5 抗腫瘤和抗癌

丁酸梭菌對抗腫瘤和抗癌有一定效果。首次發現丁酸梭菌M55具有溶癌活性是在20世紀50年代，并在20世紀70年代得到證實[21]。研究表明，丁酸梭菌代謝產物丁酸可抑制人體內結腸癌細胞及促進結腸癌細胞調亡[22-23]。研究表明，丁酸梭菌發酵產生的上清液可降低結腸癌SW-480細胞的增殖，提高其調亡率，并使其調亡周期阻滯與G0/G1期[24]。丁酸梭菌液體灌入H22肝癌小鼠胃部后發現，丁酸梭菌可抑制肝癌細胞增殖[25]。丁酸梭菌產生的胞外多聚糖對肉瘤起到完全抑制作用[26]。由于丁酸梭菌分泌的激肽酶具有分解激肽的作用，可對癌組織的毛細血管微循環造成一定的破壞，進而促使癌組織壞死，丁酸梭菌分泌丁酸可為腸上皮細胞提供能量和減少腸道致癌物質（亞硝酸胺）的致癌活性。

研究表明，益生菌可以用來預防腫瘤，是治療腫瘤的一種潛在方法，但沒有實例證明。丁酸梭菌可在腫瘤組織中選擇性的定植，進而抑制腫瘤細胞的生長[27]。丁酸梭菌既可減少腸道致癌物質的活性和溶癌的作用，還可以作為腫瘤基因治療載體。為更加有效、精準的治療腫瘤，可把TNF-α和胞嘧啶氨酶等基因轉入丁酸梭菌中，讓其在腫瘤細胞中選擇性定植[28]。

3 丁酸梭菌培養工藝

3.1 固體發酵培養

固體發酵與液體發酵相比較而言，具有產品分離難、生長難控制、方法不成熟等缺點。但固體發酵投資少、設備與操作簡單及其發酵來源廣泛（農副產品、淀粉質原料、食品工業下腳料等）和發酵產品益于長時間貯藏運輸。研究表明，以豆粕為培養基質，接種14%，30℃發酵72 h后，菌體濃度可達1.08×108cfu·mL-1[29]。此外，麥麩∶豆粕=1∶1優化組合，CaCl2為0.2%，接種72%，37℃發酵72 h，菌體濃度可達2.2×108cfu·mL-1[30]。

3.2 液體深層發酵

目前經常采用的丁酸梭菌發酵方法是液體深層發酵法，此法便于控制氧氣含量，因為丁酸梭菌屬于厭氧菌。優化培養基的成分多采用響應面法或正交試驗。研究表明，為使菌體濃度達到8×108cfu·mL-1，可采用正交實驗法優化丁酸梭菌發酵培養基組分（大豆粉20 g·L-1，葡萄糖8.0 g·L-1，啤酒酵母提取物5.0 g·L-1）[31]。同樣采用正交實驗優化丁酸梭菌最佳培養基組成，使菌體濃度達到4.1×108cfu·mL-1（葡萄糖8.0 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母膏4.0 g·L-1），芽孢轉化率達到95%（上述基礎上添加MnSO4·H2O 0.2 g·L-1、K2HPO45 g·L-1、CaCO31 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1）[32]。為使菌體濃度高達10×108cfu·mL-1，利用響應面法優化丁酸梭菌培養基（果膠 5 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、大豆提取物 39.8 g·L-1、酪蛋白 2.0 g·L-1、玉米粉 3.7 g·L-1，NaHCO31.24 g·L-1、（NH4）2SO41.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、MnSO4·H2O 0.2 g·L-1、CaCL20.02 g·L-1[33]。菌體濃度為3×108cfu·mL-1時，采用清液發酵策略，丁酸梭菌優化后的最佳培養基組分（牛肉浸膏15 g·L-1、胰蛋白胨40 g·L-1、葡萄糖34 g·L-1、可溶性淀粉1.0 g·L-1、乙酸鈉3.0 g·L-1、NaCl 5.0 g·L-1、初始pH=7.0、酵母浸粉38 g·L-1、（NH4）2SO41.0 g·L-1、半胱氨酸 0.5 g·L-1、K2HPO42.0 g·L-1[34]。為得到10×108cfu·mL-1芽孢數，通過響應法和PB實驗設計法優化丁酸梭菌發酵培養基（酵母粉6.0 g·L-1、面粉 37.2 g·L-1、米粉 39.6 g·L-1、魚粉 9.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 19 g·L-1、NaCl 1.9 g·L-1、CaCO34.8 g·L-1、NaHCO30.1 g·L-1、KH2PO40.1 g·L-1）[35]。

4 丁酸梭菌的研究與應用

目前丁酸梭菌主要被應用于體內正常菌群失衡導致的相關疾病治療，如臨床治療感染性腹瀉、炎癥性腸病、腸易激綜合征等，還應用于畜牧生產過程中。

4.1 臨床研究與應用

丁酸梭菌可以顯著治療腹瀉、炎癥、便秘等疾病，且有極強的整腸作用。研究表明，酪酸梭菌二聯活菌散可顯著降低嬰兒腹瀉的發病率[36]。同時，酪酸梭菌二聯活菌散可有效治愈潰瘍性結腸炎[37]。最先將酪酸菌相關制劑投入商業化臨床應用的國家是日本，現已形成多種產品。我國對丁酸梭菌微生態制劑的研究起步較晚，目前國內較常用的酪酸梭菌相關產品包括酪酸梭菌二聯活菌散、酪酸梭菌活菌膠囊、口服酪酸梭菌、活菌片和口服酪酸梭菌等。

4.2 丁酸梭菌在動物生產中的研究與應用

4.2.1 增強機體免疫力

在幼齡畜禽的日糧中添加丁酸梭菌可有效提高動物機體免疫功能。研究表明，丁酸梭菌（2×107cfu·kg-1）添加到肉仔雞的日糧中，可使肉仔雞血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的含量顯著增加（P＜0.05）[38]。同時，丁酸梭菌對K88大腸桿菌攻毒引起的肉雞生長性能下降有一定緩解作用，并促進攻毒后肉雞血清IgM、IgA含量和黏膜sIgA含量增加，進而提高機體免疫能力[39]。

在畜牧業中丁酸梭菌主要應用于飼料添加劑和獸藥，可有效提高動物機體抗病原微生物的能力。研究表明，仔雞服用乳酸菌、酵母菌和酪酸菌復合酪酸菌制劑，結果表明，可以預防大腸桿菌感染（97.5%）、降低大腸桿菌引起的死亡（50%），增加仔雞體重（8.28%）[40]。以美國紅魚為研究對象，飼喂丁酸梭菌菌粉飼料（1.0×109cfu·g-1），結果表明，丁酸梭菌可顯著提高美國紅魚體表粘液溶菌酶活性和血清中補體C3水平及吞噬細胞呼吸爆發活性[41]。

丁酸梭菌可抑制腸道腐敗產物的產生，增加腸內短鏈脂肪酸的生成量，促進動物排便，且抑制有害菌生長，進而在治療腸道疾病中得到廣泛應用。

4.2.2 提高動物生長性能

動物機體的消化吸收功能與腸道隱窩深度和絨毛高度密切相關，丁酸梭菌可改善動物腸道健康，進而提高動物生產性能。研究表明，丁酸梭菌（108cfu·kg-1）可有效提高仔豬平均日增重，降低料重比，降低隱窩深度，增加小腸絨毛長度，進而提高仔豬的消化能力[42]。109cfu·kg-1丁酸梭菌可增加鯰魚生產性能和降低飼料轉化系數[19]。丁酸梭菌還可提高1～24日齡肉雞平均日增重和日采食量[43]。此外，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍的復合益生菌可有效提高生長育肥豬的表觀消化率和日增重，降低料肉比[44]。

4.2.3 提高動物產品品質

丁酸梭菌除了能促進動物生長外，還可以促進腸道微生物區系穩定，對相關疾病有一定的治療效果，還可減少動物體內的藥物殘留。研究表明，肉雞飼料日糧中添加丁酸梭菌（109cfu·kg-1）和枯草芽孢桿菌（1010cfu·kg-1）的復合益生菌2%，可有效降低肉雞血清中甘油三酯和膽固醇的含量及胸肌亮度，增加肌肉的感官品質[45]。

同類復合益生菌還對生長育肥豬的大理石紋評分、肉色評分和肌肉紅度有一定的提高作用[44]。此外，單獨添加丁酸梭菌可顯著增加肉雞腿肌和胸肌的肌內脂肪含量及腿肌的肌纖維直徑，還可減少動物脂肪沉積。可能是由于丁酸梭菌的代謝產物和細胞壁成分對動物腸道上皮細胞的血管生成素樣蛋白4表達有一定的調節作用。并對脂蛋白脂肪酶活性起到抑制作用，進而阻止甘油三酯的沉積[43]。

5 小結

丁酸梭菌的理化性質具有抵抗外界惡劣環境的作用。體內受消化液、胃酸和膽汁酸影響較小，且對抗生素敏感性較弱[46]。因此丁酸梭菌廣泛應用于微生態制劑。此外，丁酸梭菌在飼料添加劑、食品添加劑、人腸炎治療藥物和獸藥中有著廣泛的應用前景。

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