參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側海馬注射阿爾茨海默病模型大鼠PI3K/AKT信號通路的影響＊

秦莉霞，吳 倩，夏鵬，高麗娟，徐世軍＊＊

（1.成都中醫藥大學藥學院 成都 611137；2.成都中醫藥大學中醫腦病藥物整合轉化研究所 成都 611137）

阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一種復雜的神經退行性疾病，是老年癡呆最常見的形式，隨著社會人口老齡化的加劇，AD發病率隨之增加，AD給家庭乃至社會帶來的經濟負擔也將日益加劇。磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（Phosphatidyl alcohol kinase/protein kinase B；PI3K/AKT）信號通路是細胞內重要的信號傳導通路之一，參與細胞增殖、能量代謝、葡萄糖代謝等多種生物學途徑[1]。多項研究顯示該信號通路參與AD多項病理進程[2]。中醫認為AD屬于“癡呆”等范疇，其病癥以瘀阻脈絡、濁毒痹阻為主，基于以上病機，中醫臨床防治AD以解毒通絡、醒神開竅等為主。參芪益智顆粒是王永炎教授治療AD的臨床經驗方，前期研究提示對5XFAD小鼠和APP/PS1小鼠有一定的抗癡呆作用[3,4]。但其對Aβ1-42雙側海馬注射AD模型大鼠的作用和PI3K/AKT信號通路的影響還未涉及。

1 材料

1.1 藥物與試劑

參芪益智顆粒，北京師范大學，批號：20151215；鹽酸多奈哌齊片，衛材（中國）藥業有限公司，批號：1511048；Aβ1-42，杭州中肽生化有限公司，批號：CK0500748；Thermo Scientific Gene JET RNA Purification Kit，賽默飛世爾科技公司，批號：K0731；Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，賽默飛世爾科技公司，批號：K1622；SYBR Premix Dimer Eraser TM（Perfect Real Time），寶日醫生物技術（北京）有限公司，批號：RR091A；PI3K抗體，abcam，批號：ab151549；AKT抗體，Cell Signaling Technology，批號：#4685。

圖1 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側注射AD大鼠Morris水迷宮的影響

引物序列如下：

1.2 動物

SPF級，SD大鼠，40只，全雄，體質量220-260 g，由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，合格證：NO：0012338。

1.3 儀器

Exp Trade C0.Ltd Morris水迷宮系統，成都泰盟軟件有限公司；BA400Digital數碼三目攝像顯微鏡，麥克奧迪實業集團有限公司；ND2000PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；i Cycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System，美國BIO-RAD公司；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，美國Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 動物造模及分組

參照文獻[5]，制備Aβ1-42（2 μg·uL-1）寡聚體，并造模[6]，假手術組動物雙側海馬注射生理鹽水，其余步驟相同。造模成功大鼠30只，隨機分為模型組（Model），陽性組（安理申組，Aricept，1.17 mg·kg-1），參芪益智顆粒高劑量組（SYG-H，9.8 g·kg-1），參芪益智顆粒中劑量組（SYG-M，4.9 g·kg-1），參芪益智顆粒低劑量組（SYG-L，2.45 g·kg-1），每組6只，另取假手術組動物6只作為空白對照（Control）。各組動物灌胃給予等體積相應藥物（10 ml·kg-1），空白組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。1次/天，連續給予60天。

2.2 學習記憶功能檢測

給藥55天后，進行Morris水迷宮實驗[7]，期間繼續給藥。定向航行實驗連續5天，記錄各組動物逃避潛伏期，定向航行實驗結束24 h后撤去平臺，進行空間探索實驗，記錄各動物穿越平臺目標象限的時間、穿越平臺目標象限的次數、穿越平臺次數及穿越平臺區域次數。

2.3 HE染色

Morris水迷宮檢測結束后，處死大鼠。取腦組織，10%甲醛固定，梯度脫水，包埋，切片（5 μm），脫蠟，染色，封片，鏡檢。

2.4 腦組織PI3KmRNA、AKT mRNA的表達

取海馬，加Lysis buffer工作液和Proteinase K工作液，提取總RNA；反轉錄：42℃ 60 min，70℃ 5 min；PCR反應：95℃ 30 s，（95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s）40個循環；計算相對于GAPDH mRNA的表達，-△△Ct=（藥物組目的基因Ct值-藥物組內參基因Ct值）-（空白組目的基因Ct值-空白組內參基因Ct值）。

2.5 腦組織PI3K、AKT蛋白表達

大鼠處死，取腦組織、免疫組化測定PI3K、AKT蛋白含量。測定平均光密度（IA）。

2.6 統計學方法

數據以均數±標準差（xˉ±s±s）表示，Morris水迷宮逃避潛伏期用雙因素方差分析，其余符合正太分布數據采用單因素方差分析（one-way ANOVA），不符合正態分布的數據采用兩個獨立樣本t檢驗進行分析。

3 結果

3.1 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側注射AD模型大鼠學習記憶功能的影響

圖2 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側注射AD大鼠海馬CA3區病理形態學的影響

圖3 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側注射AD大鼠海馬PI3K/AKT基因表達的影響

由圖1可知，隨著訓練天數的增加，各組動物逃避潛伏期均有不同程度的縮短。與空白組相比，模型組動物逃避潛伏期明顯延長（F=80.13；P＜0.001），進入平臺象限次數、穿越平臺象限百分比明顯縮短（P＜0.05）；與模型組相比，參芪益智顆粒各劑量組逃避潛伏期均明顯縮短，其中，高劑量組（F=19.35；P＜0.001）；中劑量組（F=29.48；P ＜0.001）；低劑量組（F=24.14；P＜0.001）；進入平臺象限次數和穿越平臺象限百分比均明顯增加（P＜0.05）。

3.2 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側注射AD模型大鼠海馬組織病理形態學的影響

與空白組相比，模型組海馬錐體細胞（Pyramidal cells，PC）數量減少且排列紊亂、神經細胞（nerve cell，NC）出現空泡化、壞死等現象。與模型組相比，參芪益智顆粒各劑量組動物海馬錐體細胞排列整齊，神經元數量減少、空泡化、壞死等現象均有所改善（圖2）。

3.3 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側注射AD模型大鼠海馬PI3K、AKT蛋白及基因表達的影響

與空白組比較，模型組PI3K、AKT蛋白及mRNA相對表達顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，參芪益智顆粒各劑量組PI3K、AKT蛋白呈明顯激活狀態（P＜0.05），mRNA相對表達有增加趨勢（P ＞ 0.05）（圖3、圖4、圖5、圖6）。

4 討論

圖4 各組大鼠海馬PI3K的表達

圖5 各組大鼠海馬AKT的表達

圖6 參芪益智顆粒對Aβ1-42雙側注射AD大鼠腦組織PI3K/AKT蛋白表達的影響

AD在中醫屬“呆癡”等范疇，腦失所養、腎精虧虛是其主要發病基礎，其發病部位雖然主要在腦，五臟六腑功能失調與其發病同樣密切相關[8]。早在二十世紀初，王永炎教授就提出“毒損腦絡”可作為中醫治療癡呆新的切入點[3]。參芪益智顆粒是王永炎教授長期臨床經驗的基礎上提煉的組方，方由黃芪、黃芩、人參等藥配伍組成，共奏益氣健脾、安神益智、解毒通絡之功效。方中各藥有效成分，如黃芩多種有效成分[9]，人參皂苷[10,11]，黃芪多糖[12]，丹參有效成分[13]等，對多種 AD細胞、動物模型病理進程具有不同程度的改善作用。前期實驗提示，該方可減少腦內老年斑的沉積、抑制膠質細胞過度活化、減少腦內Aβ1-42的含量，改善5XFAD小鼠學習記憶功能[3]，也可以通過調節外周血清MMP2和VEGF的含量來改善APP/PS1小鼠學習記憶功能、自發性探索運動活性和焦慮行為[8]。PI3K/AKT信號通路是胞內調控細胞增殖、分化的重要的途徑之一，可參與調節包括AD在內的多種疾病的發生、發展[14]。多種AD動物模型[15]、細胞模型[16]均顯示PI3K/AKT信號通路明顯抑制，該信號通路的抑制與脂糖代謝障礙[17,18]、認知功能障礙[19]、等密切相關，而AD病理過程中伴隨明顯的葡萄糖代謝障礙和認知功能損傷。Aβ的聚集被視為AD發生發展的關鍵因素[20]，其在腦內的異常聚集，可誘導一系列神經毒性作用從而導致AD的發生[21]，故Aβ1-42誘導的動物、細胞模型被廣泛應用于AD研究。報道顯示該模型動物可見明顯學習記憶障礙[22]，同時PI3K/AKT信號通路呈明顯抑制狀態[23]，這與本實驗結果一致，經參芪益智顆粒干預后，該模型動物學習記憶能力顯著改善，PI3K、AKT蛋白水平上明顯激活，基因水平上也可見明顯趨勢，但無統計學差異，這可能是動物樣本個體差異，數據偏差過大所致。綜上可知，參芪益智顆粒改善Aβ1-42雙側海馬注射AD模型大鼠學習記憶功能可能與以下兩方面有關：直接改善腦內AD病理變化；激活腦內PI3K/AKT信號通路，延緩AD進程。