貞蓮增免口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

杜紅娜 ，陸 安 ，賈永兵 ，劉炳煒 ，王洪禮 ，郭永紅 ，郭永國 ，劉學(xué)杰

（1.河北普德動(dòng)物藥業(yè)有限公司 050200；2.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術(shù)研究中心 050200；3.河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司 050200）

貞蓮增免口服液是在藥典方劑《二至丸》[1]基礎(chǔ)上進(jìn)行組方加減，按一定工藝制備而成的口服液，由女貞子、淫羊藿、墨旱蓮等中藥配方組成，用于提高家禽家畜機(jī)體免疫力。為有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量本研究對(duì)貞蓮增免口服液中淫羊藿、墨旱蓮進(jìn)行薄層色譜鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜法同時(shí)測定女貞子中特女貞苷和淫羊藿中淫羊藿苷兩種有效成分的含量，方法準(zhǔn)確可行，且專屬性強(qiáng)，可為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀 （德國Thermo公司），DAD檢測器，變色龍工作站；AUW120D型電子天平（日本SHIMADZU公司）；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（龍口市電爐制造廠）。

1.2 試劑與對(duì)照品特女貞苷對(duì)照品

（批號(hào) 111926-201605，含量 93.3%），淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào) 110737-200415）、旱蓮苷 A（批號(hào) 111886-201503，鑒別用）、墨旱蓮對(duì)照藥材（批號(hào)120958-201407）上述對(duì)照品及對(duì)照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；娃哈哈水。

1.3 藥材

女貞子、淫羊藿、墨旱蓮等藥材購于安國藥材市場，經(jīng)本公司質(zhì)控部鑒別均符合《中華人民共和國獸藥典》2015版（Ⅱ部）有關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 淫羊藿的薄層鑒別

取貞蓮增免口服液2mL，加甲醇10mL，超聲處理30min，過濾，取濾液作為供試品溶液；取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；另按供試品工藝制備不含淫羊藿的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；照薄層色譜法 （2015年版藥典四部通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以甲醇——丁酮——三氯甲烷——水（4：6：6：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與淫羊藿苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 淫羊藿TLC圖

2.1.2 墨旱蓮的薄層鑒別

取本品6mL，加水稀釋至25mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20mL，棄去三氯甲烷液，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為供試品溶液。另取旱蓮苷A對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取墨旱蓮對(duì)照藥材2g，加70%甲醇25mL超聲處理45min，放冷，濾過，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?5mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20mL，棄去三氯甲烷液，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；另按供試品工藝制備不含墨旱蓮的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；照薄層色譜法（2015年版藥典四部通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液5μL，對(duì)照藥材溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷——乙酸乙酯——甲醇——水（30：40：15：3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 墨旱蓮TLC圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈——水；流速：1.0mL·min-1；檢測波長 0～30min 為224nm，30～50min為 270nm。柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 供試品及陰性樣品溶液的制備

取本品1mL，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，即得。按供試品制備工藝制備不含女貞子和淫羊藿的陰性樣品，并按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

取特女貞苷、淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含特女貞苷、淫羊藿苷各150μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.4 專屬性考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液與供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。對(duì)專屬性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，陰性樣品對(duì)測定無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3 各成分HPLC色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察

稱取特女貞苷和淫羊藿苷對(duì)照品各10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，依次用甲醇稀釋至濃度 為 10μg·mL-1、100μg·mL-1、150μg·mL-1、200μg·mL-1、250μg·mL-1系列濃度混合對(duì)照品溶液，各精密量取10μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以特女貞苷和淫羊藿苷濃度為橫坐標(biāo)（X，μg·mL-1），色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為∶特女貞苷：Y＝0.1999X+0.088，（r＝1）， 淫羊藿苷：Y＝0.1624X-0.2974，（r＝0.9997）， 分別在 9.9644～249.1110μg·mL-1、10.1362～253.4050μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 重復(fù)性考察

取同一批樣品（批次：20180101），按取樣量 0.5：1.0：1.5 的比例分別取樣，各平行3份，按供試品溶液制備方法制備，照上述色譜條件測定，分別計(jì)算特女貞苷和淫羊藿苷的平均含量及平均含量的RSD值，考察方法的重復(fù)性。測得特女貞苷和淫羊藿苷平均含量分別為 7.59mg·mL-1和 3.25mg·mL-1，RSD 值為分別為1.08%和0.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 精密度考察

取同一供試品溶液，按確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積，并分別計(jì)算峰面積的RSD值，考察方法的精密度。測得特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積RSD值分別為0.33%和0.35%，表明該方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于 0，4，8，12，18，24h 進(jìn)樣 1 次，分別記錄特女貞苷和淫羊藿苷峰面積，并分別計(jì)算峰面積的RSD值，考察方法的穩(wěn)定性。測得特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積RSD值分別為0.34%和0.67%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 準(zhǔn)確度考察

取同一批樣品（批次：20180101）0.5mL，平行9份，分別精密加入高、中、低三個(gè)濃度的特女貞苷和淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行3份，按確定的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

上述結(jié)果顯示：9份供試品溶液中，特女貞苷的回收率均介于98%～102%之間，平均回收率為100.27%，RSD值為1.45%（n＝9），該方法回收率良好。9份供試品溶液中，淫羊藿苷的回收率均介于98%～102%之間，回收率均值為99.51%，RSD值為0.76%（n＝9），表明該方法準(zhǔn)確度符合要求。

2.2.10 系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)

a.柱溫變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別在柱溫為30℃、35℃、40℃進(jìn)行測定，并以特女貞苷和淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液隨行對(duì)照，分別計(jì)算特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較柱溫變化對(duì)測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表3。

表3 柱溫變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響（n=3）

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，柱溫變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結(jié)果的RSD值均小于2%，說明柱溫的變化，對(duì)樣品含量測定結(jié)果影響較小。

b.檢測波長變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別在檢測波長222 nm，224 nm，226nm測定特女貞苷含量，在檢測波長268nm，270nm，272nm測定淫羊藿苷含量，并以特女貞苷和淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液隨行對(duì)照，比較檢測波長變化對(duì)測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表4。

表4 檢測波長變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響（n=3）

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，檢測波長變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結(jié)果的RSD值均小于2%，說明檢測波長的變化，對(duì)樣品含量測定結(jié)果影響較小。

c.流動(dòng)相流速變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別以流速為0.8mL·min-1，1.0mL·min-1和1.2mL·min-1，進(jìn)行測定，并以特女貞苷和淫羊藿苷混合對(duì)照品溶液隨行對(duì)照，分別計(jì)算特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較流速變化對(duì)測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表5。

表5 流速變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響（n=3）

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，流速變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結(jié)果的RSD值均小于2%，說明流速的變化，對(duì)樣品含量測定結(jié)果影響較小。

d.流動(dòng)相比例變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別以不同比例甲醇——水為流動(dòng)相，以特女貞苷和淫羊藿苷混合對(duì)照品隨行對(duì)照，分別計(jì)算特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較流動(dòng)相比例變化對(duì)測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表6。

表6 流動(dòng)相比例變化對(duì)含量測定結(jié)果的影響（n=3）

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，流動(dòng)相比例變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結(jié)果的RSD值均小于2%，說明流動(dòng)相比例的變化，對(duì)樣品含量測定結(jié)果影響較小。

e.不同型號(hào)色譜柱對(duì)含量測定結(jié)果的影響 按確定的方法制備供試品溶液，分別用3根不同型號(hào)色譜柱按確定的色譜條件測定特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較不同型號(hào)色譜柱對(duì)測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表7。

表7 不同型號(hào)色譜柱對(duì)含量測定結(jié)果的影響（n=3）

表8 中間精密度考察結(jié)果（n=6）

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，流動(dòng)相比例變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結(jié)果的RSD值均小于2%，說明不同型號(hào)色譜柱對(duì)樣品含量測定結(jié)果影響較小。

2.2.11 中間精密度考察

按已確定的方法，分別由不同人員在不同時(shí)間、不同儀器測定同一批次口服液中特女貞苷和淫羊藿苷的含量，每次試驗(yàn)平行取樣6份，對(duì)中間精密度進(jìn)行考察。結(jié)果見表8。

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，由不同人員在不同時(shí)間、不同儀器測定同一批次樣品中特女貞苷和淫羊藿苷含量的RSD值均小于2%，表明該方法中間精密度良好。

2.3 樣品測定

取5批樣品，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算含量。結(jié)果見表9。

表9 各成分含量測定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)語

本研究參考藥典[1]及淫羊藿文獻(xiàn)［2～5］、墨旱蓮文獻(xiàn)［6～8］，通過TLC薄層色譜條件的摸索，分別篩選出最佳展開條件，完成淫羊藿和墨旱蓮TLC鑒別標(biāo)準(zhǔn)的制定；與此同時(shí)，對(duì)“女貞子”的鑒別也進(jìn)行了考察，但初步摸索發(fā)現(xiàn)陰性樣品存在干擾，通過調(diào)整展開劑系統(tǒng)及供試品溶液制備方法［9～12］，均未得到較好的檢測結(jié)果。經(jīng)查閱文獻(xiàn)［13］發(fā)現(xiàn)，淫羊藿中存在齊墩果酸成分，這可能是造成陰性干擾的原因。因此，女貞子的鑒別未載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，下一步科研有待深入研究。

中藥復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜多樣，僅對(duì)其中單一成分進(jìn)行檢測，不能全面反映中藥制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)和化學(xué)成分群的復(fù)雜性，也無法體現(xiàn)制劑整體質(zhì)量情況。近年來，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分析技術(shù)的不斷提升，中藥復(fù)方質(zhì)量評(píng)價(jià)由單一指標(biāo)性成分檢測體系向多組分檢測體系發(fā)展［14］。在貞蓮增免口服液中，淫羊藿苷為淫羊藿主要有效成分，特女貞苷為女貞子中環(huán)烯醚萜類的主要活性成分，因此，本研究建立了HPLC同時(shí)測定特女貞苷和淫羊藿苷含量的高效液相色譜法。對(duì)特女貞苷、淫羊藿苷對(duì)照品進(jìn)行全波長掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，前者在224nm有最大吸收，后者在270nm有最大吸收，同文獻(xiàn)［15］結(jié)果一致，故確定檢測波長為224nm和270nm，采用波長切換HPLC同時(shí)測定特女貞苷和淫羊藿苷的含量。

本研究將藥典組方“二至丸”進(jìn)行組方調(diào)整制備口服液，由丸劑到口服液劑型的改變，使用更方便，便于體內(nèi)消化吸收，為了確保其質(zhì)量及用藥安全，通過TLC定性鑒別和HPLC定量測定來進(jìn)行質(zhì)量控制研究。結(jié)果表明質(zhì)量控制方法準(zhǔn)確可靠、專屬性高，可為貞蓮增免口服液制劑提供有效的質(zhì)量控制方法。