HPLC同時測定寬葉羌活藥材中5種成分含量

唐國琳 ，黃鳳，高天元，吳情梅，喻文，邱慧，蔣桂華

寬葉羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.為傘形科羌活屬多年生草本植物，俗稱黑藥，藥用部位主要為其干燥根莖及根[1]，主要分布在四川西北部、青海、甘肅、西藏東部等高原地區[2]。在臨床上常用于治療風寒感冒、頭痛、風濕痹痛等癥[3-4]。現代研究表明寬葉羌活藥材具有抗炎、鎮痛解熱、抗心律失常、抗心肌缺血和抗菌等作用[4]。揮發油、香豆素類、有機酸類化合物是寬葉羌活中最主要的三大類活性成分[5]。研究發現阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗輻射和抗腫瘤等作用[6-9]；羌活醇和異歐前胡素具有鎮痛、舒張血管[10]、抗病毒活性[11]作用；紫花前胡苷有鎮痛[12]、抗炎[13]、改善學習記憶[14]等作用；佛手柑內酯有抗衰老、抗腫瘤等作用[15-17]。

關于寬葉羌活藥材的成分含量測定已有許多報道，但只是測定其中的2或3種成分[18-20]，如高建邦等人同時測定了異歐前胡素和阿魏酸的含量。目前中國藥典2015年版一部主要以羌活醇和異歐前胡素的含量之和控制寬葉羌活藥材的質量。眾所周知中藥的多效性源于其復雜的化學成分，僅靠一兩個成分的含量測定不能反映其他成分的情況，難以真正控制其質量。選擇上述5 種成分作為指標進行質量控制研究，更能合理、全面評價寬葉羌活藥材質量。因此本實驗擬建立同時測定上述5種成分的高效液相色譜法，并對不同批次寬葉羌活藥材進行含量測定，為更進一步全面評價寬葉羌活藥材質量提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、KQ5200E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）、SQP型電子分析天平（萬分之一賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。

1.2 試藥

有機溶劑包括甲醇（分析純）、冰醋酸（成都市科隆化學品有限公司）；色譜乙腈（成都市科隆化學品有限公司）；純凈水。對照品阿魏酸、佛手柑內酯、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素均購自于成都曼斯特生物科技有限公司，各對照品純度都達99%及其以上。

樣品分別來自四川白玉縣、小金縣；青海祁連縣、班瑪縣；甘肅宕昌縣；共計13批。經成都中醫藥大學蔣桂華教授鑒定均為傘形科植物寬葉羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.的干燥根及根莖。

表1 不同批次寬葉羌活藥材樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

GL Sciences Wondasil C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；乙腈（B）-0.3%醋酸水（A）為流動相；流速1 mL﹒min-1；梯度洗脫（0～14min，15%～35%B；14～20min，35%B；20～35min，35%～60%B；35～40min，60%～75%B；40～42min，75%～15%B；42～50min，15%B）；柱溫25℃；檢測波長為315 nm；進樣量10μL。對照品及樣品的高效液相色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

取對照品紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素各適量，精密稱定，以甲醇溶解，搖勻并定容，制成含紫花前胡苷（239.00μg﹒mL-1、阿魏酸 （174.00μg﹒mL-1）、佛手柑內酯（237.00μg﹒mL-1）、羌活醇 （270.00μg﹒mL-1） 和異歐前胡素（217.00μg﹒mL-1） 的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

參考《中國藥典》2015年版并結合文獻[20、22]，選擇以下提取條件：取寬葉羌活粉末（過三號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定其質量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

圖 1 對照品（A）及寬葉羌活藥材樣品（B）HPLC圖

2.4 線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液4，8，12，16，20 μL按2.1項下色譜條件進行分析，測定峰面積。以對照品峰面積為縱坐標（Y），以對照品進樣量X（μg）為橫坐標，得線性回歸方程，結果見表2。

表2 5個成分的線性回歸方程、相關系數和線性范圍

2.5 精密度試驗

取同一寬葉羌活藥材（3號）樣品約0.3 g，精密稱定，用2.3項下的制樣方法制備樣品，在同一色譜條件下連續進樣6次，進樣體積均為10μL，記錄5個成分的色譜峰面積。結果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD分別是1.87%，0.71%，0.53%， 1.89%，1.87%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一寬葉羌活藥材（3號）樣品約0.3 g，精密稱定，用2.3項下方法制備1份樣品，在同一色譜條件下，分別在0，2，4，8，16，24 h進樣，分別計算5種成分峰面積的RSD。結果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD分別是0.84%，1.59%，1.11%， 1.77%，1.24%。表明供試品溶液24h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

分別稱取6份同一寬葉羌活藥材（3號）樣品，各約0.3 g，精密稱定，按2.3項下方法制樣，并進行測定。結果表明，紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素6次測定值的RSD分別為2.57%，2.56%，1.83%， 2.98%，1.17%。表明方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一寬葉羌活藥材（3號）樣品0.1 g，精密稱定，取混合對照溶液2 ml，用甲醇定容至25 ml，得紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內酯、羌活醇、異歐前胡素濃度分別為19.20 mg﹒L-1、13.98 mg﹒L-1、19.00 mg﹒L-1、21.6 mg﹒L-1、17.4 mg﹒L-1的新混合對照品溶液，分別取0.5、1.0、2.0 ml作為加標溶液，每個濃度平行3次。按2.3項下的方法制樣，按2.1項下色譜條件進樣分析，計算回收率，結果見下表3。

表3 加樣回收率試驗（n=3）

0.0192 1.6407 97.39 0.0384 1.6608 101.04阿魏酸 0.587 0.0070 0.5938 97.14 98.08 0.97 0.0140 0.6008 98.57 0.0280 0.6147 98.93佛手柑內酯 2.099 0.0095 2.1081 95.80 97.37 1.62 0.0190 2.1178 98.95 0.0380 2.1360 97.37羌活醇 1.889 0.0108 1.8997 99.07 100.54 1.39 0.0216 1.9110 101.85 0.0432 1.9352 100.69異歐前胡素 1.495 0.0087 1.5040 103.45 102.59 0.74 0.0174 1.5128 102.3 0.0348 1.5305 102.01

2.9 樣品測定

取不同批次的寬葉羌活樣品各0.3 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試液，按照2.1項下色譜條件注入液相色譜儀，每批平行測定2次，記錄峰面積，用標準曲線計算出含量。結果見表4。

表4 不同批次寬葉羌活樣品中主要成分的比較（n=2）（mg﹒g-1）

從表4可以看出：不同產地的寬葉羌活藥材，各成分的含量變化范圍較大。整體來說，寬葉羌活栽培品的異歐前胡素含量較之野生品高，野生品的羌活醇、紫花前胡苷含量較之栽培品高，與文獻報道一致[21]。關于栽培品與野生品中羌活醇與異歐前胡素的具體關系，有待進一步研究。

不同產地各成分含量差異很大，可能與采收時間有關。青海的羌活與其它產地產的紫花前胡苷含量差異巨大，其原因值得進一步探討。

3 討論

3.1 提取溶劑和提取方法的選擇

本實驗比較了甲醇（25 ml、50 ml）、乙醇、甲醇水（80%）、乙醇水（75%）四種溶劑。提取方法比較了超聲提取和加熱回流以及不同提取時間（30 min、45 min、60 min）。水提取使樣品中香豆素類峰面積降低，且明顯低于醇提樣品所得峰面積；甲醇提取時總色譜峰面積大于乙醇提取得到的總峰面積；超聲提取易操作。故最終提取溶劑和方法為：加甲醇25 ml超聲30 min。

3.2 測定波長的確定

采用二極管陣列檢測器，對5個被測成分進行190～400 nm 全波長掃描，圖譜結果顯示在315 nm處均有較大吸收，出峰數量多，故選315 nm作為檢測波長。

3.3 色譜條件優化

對常用流動相（甲醇-水、乙腈-水、 甲醇-0.3%醋酸水、乙腈-0.3%醋酸水）及流動相梯度分別進行了考察，結果表明乙腈-0.3%醋酸水、梯度洗脫效果好。并在此基礎上考察了柱溫（25 ℃、30 ℃）和體積流量（0.8、1 ml/min）對分離效果的影響，柱溫25 ℃，體積流量0. 8 mL/min時分離效果好。