冬蟲夏草內生菌Mucor luteus化學成分研究

韓雪花，李小華，王麗娜，何鑫，秦玲玲，郭大樂，鄧赟

植物內生菌（Endophyte）是指在一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官內部的真菌或細菌的統稱，現一般指植物內生真菌。自Kloepper[1]第一次提出“植物內生菌”的概念開始，內生菌的研究越來越深入。內生菌除了與植物存在互利共生的關系，還能夠通過產生一些與宿主植物相同或相似的化合物來對抗相同的外界環境脅迫，所以對植物內生菌的次級代謝產物進行研究不僅能夠拓寬藥用資源，還可以在一定程度上保護天然藥用植物資源。從植物中分離內生菌，并對其次級代謝產物進行研究已經成為目前天然產物研究領域的熱點內容之一[2]。

冬蟲夏草為麥角菌科（Clavicipitaceae）真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體。性平，味甘，歸肺、腎經，具有補腎益肺，止血化痰的功效。主要含粗蛋白、粗脂肪、總糖、粗纖維，此外還含有氨基酸、脂肪酸、核苷類物質、甾醇、甘露醇、多糖等，具有增強免疫、抗腫瘤、改善肺心病患者血管功能等活性[3-4]。

本實驗從新鮮冬蟲夏草中分離得到一株內生菌，通過ITS測序比對鑒定為毛霉菌M. luteus，將其進行液體發酵培養后得到發酵產物，并對發酵產物的乙酸乙酯萃取部位進行化學成分研究，從中分離得到8個化合物，分別鑒定為：20-O-methyl-24-epi-cyclocitrinol（1），（15S）-15-hydroxy-24-epi-cyclocitrinol（2），（16R）-16-hydroxy-24-epicyclocitrinol（3），coniochaetones B（4），4-Hydroxybenzoic acid（5），benzoic acid（6），5,5'-diisobutoxy-2,2'-bifuran（7），bis（2-ethylhexyl）phthalate（8），化合物1-5,7-8均為首次從M. luteus中分離得到。化合物結構如圖1所示：

圖1 化合物1-8的結構

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Finnigan-LCQDECA質譜儀（美國賽默飛世爾公司）；Bruker Ascend 400核磁共振儀（TMS為內標）（德國布魯克公司）；十萬分之一電子天平（瑞士奧豪斯DV-215-CD，上海顧村電光儀器廠）；中壓層析柱（利穗科技（蘇州）有限公司）；SHB-IIIS循環水式多用真空泵（上海躍進醫療器械廠）；RE52CS旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；恒溫培養振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；恒溫恒濕培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；優普UPT系列超純水器（成都優普電子產品有限公司）；NP7000型制備型高效液相色譜儀（江蘇漢邦儀器有限公司）。柱層析硅膠（200-300目）、薄層層析硅膠板（5×10 cm，GF254）（青島海洋化工廠）； C18反相填料（日本YMC株式會社）。石油醚、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇（成都科龍化工試劑廠，均為分析純）。

冬蟲夏草于2016年5月采集于甘肅省夏河縣，由成都中醫藥大學蔣桂華教授鑒定為麥角菌科（Clavicipitaceae）真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體，樣品保存在成都中醫藥大學藥學院生化制藥實驗室（編號DCXC-20160503-GSSXHX）。

1.2 培養基

孟加拉紅固體培養基：35 g孟加拉紅培養基，水1 L，煮沸溶解，pH自然。

PDA斜面培養基：土豆200 g加入自來水煮至軟爛后過濾，濾液定容至1 L，濾液加入瓊脂15～20 g﹒L-1，鏈霉素30 mg﹒L-1，葡萄糖20 g﹒L-1煮沸溶解，pH自然。

PDB液體培養基：土豆200 g加入自來水煮至軟爛后過濾，濾液定容至1 L，濾液加入葡萄糖20 g﹒L-1，MgSO41.5 g﹒L-1，NaCl 2.0 g﹒L-1，K2HPO41.0 g﹒L-1，MgCl20.2 g﹒L-1，（NH4）3PO40.2 g﹒L-1煮沸溶解，pH自然。

2 實驗方法

2.1 菌株的分離及鑒定

將采集的冬蟲夏草的表面清洗干凈，進行表面消毒，在無菌操作室的無菌操作臺中用75%的乙醇消毒1 min，然后用無菌水沖洗3次，最后用無菌濾紙片吸干表面的水分，消毒完畢后在無菌條件下，用滅菌剪刀將根和莖剪成2 mm長的小段，接種于孟加拉紅培養基上，待生長出菌落時挑出，在新的平板上培養純化。

將純化得到的菌株交于生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將獲得的18S rRNA基因序列提交到NCBI的GenBank基因庫，BLAST比對，與數據庫中的已知序列進行同源性分析，該菌株與Mucor luteus相似度為99%，故鑒定為毛霉菌M. luteus。菌種保存于成都中醫藥大學藥學院生化制藥實驗室，編號為（DCXC-20160503-GSSXHX-20160512-3），ITS序列如下：。

TTTATATTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTA AATCAGTTATGATCTACGTGACATATTCTTTACTA CTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACA TGCAAAAAAACCCTGACTTCGGAAGGGGTGCA CTTATTAGATAAAGCCAACGCGGGGTAAAACCT GTTTCCCTTGGTGATTCATAATAATTAAGCGGATC GCATGGCCTTGTGCTAGCGACGGTCCACTCGAT TTTCTGCCCTATCATGGTTGAGATTGTAAGATAG AGGCTTACAATGCCTACAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAA ACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGC GCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGT GACAATAAATAACAATGCAGGGCCTTTAAGGTCT TGCAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAA CGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAG CAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATAT TAAAGTTGTTGCAGTTAAAACGTCCGTAGTCAAA TTTTAGTCTTTAGGCGAAGTGGCCTGGTCTTCAT TGATCAAGCTCGTTTCTGCCGAGACTTTTTTTTT GGTTATGCTACTGTTGGCTTCGGTCGGCGGTAGT CTCTAGCCAAATGATTACCATGAGCAAATCAGAG TGTTTAAAGCAGGCTTTCAAGCTTGAATGTGTTA GCATGGAATAATGAAATATGACTTTAGTCCCTATT TCGTTGGTTCAGGAACTTAAGTAATGATGAATAG AAACGGTTGGGGGCATTTGTATTTGGTCGCTAGA GGTGAAATTCTTGGATTGACCGAAGACAAACTA CTGCGAAAGCATTTGACCCAGGACGTTTTCATTG ATCAAGGTCTAAAGTTAAGGGATCGAAGACGAT TAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGC CGACTAGCGATTGGGCCTGTTTATTATGACTGGC TCAGCAGCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGTT CTGGGGGGAGTATGGGACGCAAGGCTGAAACTT AAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGT GGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGG AAACTCACCAGGTCCAGACATAGTAAGGATTGA CAGATTGAAAGCTCTTTCTAGATTCTATGGGTGG TGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTCGTGGAGTGATT TGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACCTTA TTCTGCTAAATAGGCAGGTCAACTTTTTAGTTGA TTAATTTATTTATAAATCTGGCTCTAGAGAG

2.2 發酵培養

將活化后的該菌株用接種針挑取適量菌絲體接種至已滅菌含80 mL培養液的250 mL或150 mL培養液的500 mL三角瓶中在25 ℃，120 rpm搖床上培養7 d，共發酵培養40 L。

2.3 提取分離

將發酵產物進行抽濾得濾液，濾液用同體積乙酸乙酯萃取三次，減壓濃縮得提取物浸膏2.7 g，浸膏過硅膠（200～300目）柱層析，以石油醚-丙酮（100∶0→ 1∶1）梯度洗脫，經薄層色譜檢測合并相似組分后得10個組分（Fr1～Fr10），將Fr2經HPLC制備，以甲醇-水（74∶26，v/v，流速3 mL﹒min-1）洗脫，得到化合物1（2.3 mg，Rt = 14.9 min）和組分Fr2-2，將組分Fr2-2以甲醇-水（55∶45，v/v，流速3 mL﹒min-1）洗脫，得到化合物2（6.8 mg，Rt= 27.1 min）和化合物3（7.1 mg，Rt= 30.0 min）；將Fr3經HPLC制備，以甲醇-水（50∶50，v/v，流速3 mL﹒min-1）洗脫，得到化合物4（2.0 mg，Rt= 26.1 min）；將Fr5經HPLC制備，以（甲醇-水，15∶75，v/v，流速3 mL﹒min-1）洗脫，得到化合物5（2.3 mg，Rt= 22.9 min）；將Fr7經HPLC制備，以甲醇-水（45∶55，v/v，流速3 mL﹒min-1）洗脫，得到化合物6（12.1 mg，Rt = 26.1 min）。將Fr8經HPLC制備，以甲醇-水（70∶30，v/v，流速3 mL﹒min-1）洗脫，得到化合物7（7.2 mg，Rt = 52.5 min）；將Fr9經HPLC制備以甲醇-水（85∶15，v/v，流速3 mL﹒min-1）洗脫，得到化合物8（2.4 mg，Rt= 93.6 min）。

3 實驗結果

3.1 結構鑒定

化合物1 白色粉末；ESI-MSm/z415 [M+H]+。1H NMR （400 MHz, CD3OD） δ: 5.70 （1H, dd,J= 16.0,0.9 Hz, H-22）, 5.59 （2H, dd,J= 13.5, 6.5 Hz, H-7, 23）,5.54 （1H, d,J= 6.1 Hz, H-1）, 4.30-4.23 （1H, m, H-24）,3.45 （1H, m, H-3）, 3.11 （3H, s, -OCH3）, 2.83 （1H, dd,J= 12.1, 5.4 Hz, H-4α）, 2.76 （2H, d,J=4.2 Hz, H-5, 9）,2.66-2.55 （2H, m, H-18）, 2.51-2.43 （1H, m, H-2β）, 2.25-2.15 （3H, m, H-2α, 12β, 14）, 1.82-1.73 （3H, m, H-16,17,）, 1.69-1.64 （2H, m, H-4β, 11β）, 1.58 （2H, ddd,J=15.7, 12.3, 4.5 Hz, H-11α, 15β）, 1.49 （2H, dd,J= 12.7,4.3 Hz, H-12α, 15α）, 1.31 （3H, s, H-21）, 1.24 （3H, d,J= 6.4 Hz, H-25）, 0.78 （3H, s, H-19）;13C NMR （100 MHz, CD3OD） δ: 207.7 （C-6）, 160.3 （C-8）, 147.7 （C-10）, 135.9 （C-22）, 135.1 （C-23）, 125.7 （C-7）, 123.0 （C-1）,81.0 （C-20）, 69.1 （C-24）, 65.3 （C-3）, 61.9 （C-17）, 57.0（C-14）, 55.6 （C-9）, 50.0 （23-OCH3）, 47.7 （C-5）, 46.7 （C-13）, 42.2 （C-4）, 40.7 （C-12）, 36.9 （C-2）, 28.9 （C-18）,28.5 （C-11）, 23.8 （C-25）, 23.5 （C-16）, 22.1 （C-21）, 22.0（C-15）, 15.2 （C-19）。以上數據與文獻[5]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為20-O-methyl-24-epi-cyclocitrinol。

化合物2 白色粉末；ESI-MS m/z 417 [M+H]+。1H NMR （400 MHz, CD3OD） δ: 5.79 （1H, d,J= 15.7 Hz, H-1）, 5.66-5.57 （2H, m, H-22, 23）, 5.53 （1H, s,H-7）, 4.28-4.20 （2H, m, H-15α, 24）, 3.25 （1H, m, H-3）,2.88-2.73 （3H, m, H-4α, 5, 9）, 2.66-2.55 （2H, m, H-18）,2.52-2.42 （1H, m, H-2β）, 2.21 （4H, dd,J= 19.9, 13.3 Hz, H-2α, 12β, 14, 16β）, 1.93-1.79 （2H, m, H-11β, 17）,1.74 （1H, dd,J= 15.2, 8.9 Hz, H-4β）, 1.70-1.48 （3H, m,H-11α, 12α, 16α）, 1.32 （3H, s, H-21）, 1.22 （3H, d, J =6.3 Hz, H-25）, 0.81 （3H, s, H-19）;13C NMR （100 MHz,CD3OD） δ: 207.6 （C-6）, 160.2 （C-8）, 147.6 （C-10）, 138.0（C-22）, 131.8 （C-23）, 125.7 （C-7）, 123.1 （C-1）, 75.7 （C-20）, 69.5 （C-24）, 69.2 （C-15）, 65.3 （C-3）, 63.9 （C-14）,57.1 （C-17）, 55.5 （C-9）, 50.0 （C-5）, 47.6 （C-13）, 42.2（C-4）, 40.6 （C-12）, 36.8 （C-2）, 35.1 （C-16）, 29.0 （C-18）,28.8 （C-21）, 28.5 （C-11）, 23.8 （C-25）, 15.0 （C-19）。以上數據與文獻[6]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為（15S）-15-hydroxy-24-epi-cyclocitrinol。

化合物3白色粉末；ESI-MSm/z417 [M+H]+。1H NMR （400 MHz, CD3OD） δ: 5.79 （1H, dd,J= 15.7,1.0 Hz, H-1）, 5.66-5.58 （2H, m, H-22, 23）, 5.53 （1H, s,H-7）, 4.24 （2H, brdd,J= 5.6 Hz, H-16α, 24）, 3.25（1H,m, H-3）, 2.84 （2H, dd,J= 11.9, 5.0 Hz, H-5, 9）, 2.78-2.73 （1H, m, H-4α）, 2.66-2.55 （1H, m, H-18α）, 2.47 （2H,ddd,J= 13.3, 11.4, 6.2 Hz, H-2β, 14, ）, 2.27-2.16 （2H,m, H-2α, 12β）, 1.92-1.83 （1H, m, H-15β）, 1.82-1.73 （1H,m, H-11β）, 1.70-1.64 （1H, m, H-17）, 1.64-1.49 （5H, m,H-4β, 5, 11α, 12α, 15α）, 1.32 （3H, s, H-21）, 1.23 （3H,d,J= 6.4 Hz, H-25）, 0.82 （3H, s, H-19）;13C NMR （100 MHz, CD3OD） δ: 207.6 （C-6）, 160.2 （C-8）, 147.6 （C-10）, 137.8 （C-22）, 131.9 （C-23）, 125.7 （C-7）, 123.1 （C-1）, 75.8 （C-20）, 72.8 （C-16）, 71.5 （C-17）, 69.0 （C-24）,65.3 （C-3）, 57.1 （C-14）, 55.5 （C-9）, 50.0 （C-5）, 49.9 （C-13）, 42.2 （C-4）, 40.6 （C-12）, 36.8 （C-2）, 36.1 （C-15）,29.0 （C-21）, 28.9 （C-18）, 28.5 （C-11）, 23.8 （C-25）, 15.0（C-19）。以上數據與文獻[7]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為（16R）-16-hydroxy-24-epicyclocitrinol。

化合物4 白色粉末；ESI-MSm/z233 [M+H]+。1H NMR （400 MHz, CDCl3） δ: 12.27 （1H ,s, 8-OH）, 12.27（1H, s, 1-OH）, 6.72 （1H, s, H-5）, 6.63 （1H, s, H-7）, 5.45（1H, d,J= 5.2 Hz, H-1）, 3.11 （1H, m, H-3β）, 2.83 （1H ddd,J= 18.0, 9.3, 5.0 Hz, H-3α）, 2.51 （1H, td,J=13.9,8.1 Hz, H-2a）, 2.36 （3H, m, 6-CH3）, 2.04 （1H, m, H-2b）;13C NMR （100 MHz, CDCl3） δ: 181.5（C-9）, 172.1 （C-5）, 161.0 （C-8）, 157.9 （C-4a）, 147.0 （C-6）, 121.3 （C-9a）, 112.8 （C-7）, 109.2 （C-8a）, 108.0 （C-5）, 71.3 （C-1）,30.1 （C-3）, 29. 6 （C-2）, 22.5 （C-6）。以上數據與文獻[8]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為coniochaetones B。

化合物5白色粉末；ESI-MSm/z: 138 [M + H]+。1H NMR （400 MHz, CDCl3） δ: 8.01 （2H, m, H-2, 6）, 6.97（2H, m, H-3, 5）;13C NMR （100 MHz, CDCl3） δ: 165.9（C-7）, 163.3 （C-4）, 133.2 （C-2, 6）, 122.9 （C-1）, 115.8（C-3, 5）。以上數據與文獻[9]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為4-Hydroxybenzoic acid。

化合物6白色粉末；ESI-MSm/z: 121 [M-H]-。1H NMR （400 MHz, CDCl3） δ: 8.17 （2H, d,J= 7.2 Hz,H-2, 6）, 7.65 （1H, t,J= 7.0 Hz, H-4）, 7.55 （2H, t,J= 7.1 Hz, H-3, 5）;13C NMR （100 MHz, CDCl3） δ: 173.6 （C-7）,134.2 （C-4）, 131.0 （C-2, 6）, 128.7 （C-1）, 127.5 （C-3, 5）。以上數據與文獻[10]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為benzoic acid。

化合物7無色油狀；ESI-MSm/z279 [M+H]+。1H NMR （400 MHz, CDCl3） δ: 7.71 （2H ,dd,J= 5.7, 3.3 Hz, H-3, 3'）, 7.52 （2H, dd,J= 5.7, 3.3 Hz, H-4, 4'）, 4.31（2H, t,J= 6.7 Hz, H-6, 6'）, 1.72 （2H ,dt,J= 14.6, 6.8 Hz, H-7, 7'）, 1.44 （2H, d,J= 14.7, 7.4 Hz, H-8, 8'）, 0.96（6H t,J= 7.4 Hz, H-9, 9'）;13C NMR （100 MHz, CDCl3）δ: 167.9 （C-5, 5'）, 132.5 （C-2, 2'）, 131.0 （C-4, 4'）, 129.0（C-3, 3'）, 65.7 （C-6, 6'）, 30.7 （C-7, 7'）, 19.3 （C-8, 8'）,13.9 （C-9, 9'）。以上數據與文獻[11]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為5,5'-diisobutoxy-2,2'-bifuran。

化合物8黃色油狀；ESI-MSm/z389 [M-H]-。1H NMR （400 MHz, CDCl3） δ: 7.71 （2H, m, H-3'', 6''）,7.53 （2H, dd,J= 4.7, 2.4 Hz, H-4'', 5''）, 4.21 （4H, dd,J= 13.6, 8.7 Hz, H-1, 1'）, 1.72 （2H, m, H-2, 2'）, 1.45-1.25 （16H, m, H-3, 3', 4, 4', 5, 5', 7, 7'）, 0.96-0.86 （12H,m ,H-6, 6', 8, 8'）;13C NMR （100 MHz, CDCl3） δ: 167.9（2×C=O）, 132.6 （C-1'', 2''）, 131.0 （C-3'', 6''）,129.0 （C-4'',5''）, 68.3 （C-1, 1'）, 38.9 （C-2, 2'）, 30.5 （C-3, 3'）, 29.1 （C-4,4'）, 23.9 （C-7, 7'）, 23.1 （C-5, 5'）, 14.2 （C-8, 8'）, 11.1 （C-6, 6'）。以上數據與文獻[12]中報道的波譜數據基本一致，故將該化合物鑒定為bis（2-ethylhexyl）phthalate。

4 結論與討論

本次實驗從新鮮冬蟲夏草藥材中分離得到一株內生菌，通過ITS測序比對鑒定為毛霉菌M. luteus，毛霉菌又名黑霉、長毛霉，是接合菌亞門接合菌綱毛霉目毛霉科真菌中的一個大屬，存在于禾草、土壤、糞便等環境中，在高溫、高濕度以及通風不良的條件下生長良好。將其進行液體發酵后得到次級代謝產物，從中共分離鑒定了8個化合物，其中1～5,7～8共計7個化合物為首次從M. luteus中分離得到。經查閱相關文獻報道，從化合物1具有抑制人細胞癌的作用[5]，化合物8能夠通過影響與激素相關基因蛋白的表達從而引起內分泌紊亂并干擾大鼠性激素的合成，從而使其生殖功能產生障礙[13]。此外，毛霉菌的次級代謝產物1-Hydroxy-4-methyl-2,4,6-dodecatrienoic acid還具有細胞毒活性[14]、吲哚二萜類化合物采用MTT和SRB方法使用阿霉素用作陽性對照，發現對HL-60（人白血病）和A549（人肺腺癌）細胞有細胞毒活性[15]。