我國蟲生真菌的研究現狀

余垚穎，郭應菊，楊 雪，王明富

(四川省農業科學院植物保護研究所，四川 成都 610066)

蟲生真菌是寄生在昆蟲、蜘蛛等幼蟲或成蟲上的真菌。我國已報道昆蟲病原真菌有400多種，其中寄生昆蟲的真菌215種[1]，作為殺蟲劑的種類主要有白僵菌(Beauveria)、綠僵菌(Metarhizium)、玫色擬青霉(P.fumosoroseus)、蠟蚧輪枝菌(Verticilliumlecantii)、湯氏被毛孢(H.thompsonii)、座殼孢(Aschersonia)、鐮刀菌(Fusarium)、蟲霉目(E.muscae)等[2]；作為藥用真菌的冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)、蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)、蟬花(C.cicadae)等[3]。目前，我國擁有世界上最大的蟲生真菌研究隊伍，其次為美國、巴西和英國等不同國家的研究團隊，研究主要集中在分子生物學、致病機理、害蟲生物防治、育種工程等方面。

1 蟲生真菌研究動態

1.1 分子生物學研究

蟲生真菌在分子生物學方面的研究是為了解決蟲生真菌殺蟲速率緩慢的弱點，以期從分子生物學水平上提高菌株的殺蟲毒力，在最大程度及范圍上發揮蟲生真菌在害蟲控制上的優勢及潛力[4]。主要分為以下幾個步驟：①蛋白酶純化：目前所分離、純化的酶類主要是蟲生真菌入侵昆蟲體壁過程中所產生的蛋白酶類，因而在不同程度上表現與菌株毒力相關。如St Leger由巨大蜚蠊(Blaverus gigantesu)體壁離體誘導試驗表明：金龜子綠僵菌孢子萌發過程至少有42種蛋白產生，其中主要為酸性蛋白酶(pl4.2-5.6)，這些酶類一般均由結構不同的同工酶組成為一個酶系[5]。②基因克隆：利用不斷改進的克隆技術，各類生物模式種的遺傳密碼正逐步得到詮釋，蟲生真菌中約有20余種基因被克隆測序，研究表明：蟲生真菌的毒力基因多以基因簇(gene cluster)的形式存在[6-7]。③表達調控：蟲生真菌不同蛋白酶的結構基因被克隆、測序后，人們最感興趣的還是其精確表達調控的機理，從而爭取得到人為設計和調控的目的。④基因工程，主要體現在3個方面：一是將蟲生真菌作為宿主細胞接受外源基因的試驗；二是將蟲生真菌的毒力因子(如pr1基因)導入殺蟲真菌受體菌，構建永久型表達的菌株，以提高真菌的殺蟲效率；三是使用帶有外源基因的穩定轉化子進行釋放試驗，以驗證工程菌株的環境穩定性及與當地菌株的基因交流情況。

1.2 致病機理研究

蟲生真菌侵染寄主的復雜過程主要可分為3個階段：①體表附著階段；②體壁穿透階段；③體內定殖及致死階段[8]。整個過程涉及寄主識別、機械破壞、營養競爭、代謝干擾、毒素分泌及寄主組織結構破壞等，這些多因子作用最終導致寄主死亡[9]。

1.2.1 體表附著階段 蟲生真菌附著體表階段又可分為2個不同階段[10]：①非特異性附著階段，主要是疏水孢子與疏水昆蟲體壁進行被動附著，附著力較弱。如Wang 等[11]研究發現金龜子綠僵菌孢子表面的粘著蛋白(adhesin)MAD1基因，伴隨孢子萌發，該基因表達水平逐漸增強。該基因被缺失后，綠僵菌孢子對寄主體表的附著能力顯著下降。②特異性的主動附著階段，通過誘導分泌的孢外蛋白酶類作用分生孢子牢固地附著在昆蟲體壁上。

1.2.2 體壁穿透階段 蟲生真菌的體壁穿透階段分為2個不同的階段：①附著胞的形成：昆蟲體壁由外向內可分為上表皮、前表皮、后表皮和皮脂層4層結構，主要由蛋白質和幾丁質組成，是防止大多數病原微生物入侵的有效物理屏障。研究表明，至少有Ca2+和cAMP 2種第二信使參與信號傳導途徑與附著胞的形成有關[12]。②分解寄主外殼的水解酶：蟲生真菌在入侵昆蟲體壁的過程中，會分泌蛋白酶、幾丁質酶、脂酶等多種胞外水解酶類[13]。蛋白酶的降解作用不僅利于菌絲穿透侵入，同時也為菌絲的生長提供營養物質。

1.2.3 體內定殖階段 體內定殖階段分為3個階段：①免疫抵抗反應：蟲生真菌侵染至昆蟲血腔后，面臨著宿主的細胞免疫及體液免疫作用，蟲生真菌要實現成功的侵染定殖必須戰勝宿主的一系列免疫保護反應。②分泌毒素：蟲生真菌之所以能夠克服寄主的免疫殺菌作用，不但與其細胞壁結構重新包裝改造有關，而且還同真菌分泌的毒性次生代謝產物有關。③體內生長：在感染寄主的過程中，蟲生真菌抵抗宿主免疫作用的最終目的是為了進行有效的生長繁殖。

1.3 毒力基因工程研究

蟲生真菌基因工程改良首先取決于高效轉化體系的建立，目前廣泛采用的轉化方法除了經典的PEG/原生質體轉化法、限制性內切酶介導的轉化法、醋酸鋰轉化法、電擊法和基因槍法。借助于植物細胞轉化的根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法(ATMT)在真菌細胞轉化中得到了成功應用，包括在蟲生真菌轉化中的成功應用[14-15]。ATMT以操作簡便、轉化效率高和易于得到穩定轉化子等優點而得到了廣泛的應用。

1.4 生物防治中應用研究

生物防治中應用最廣的蟲生真菌是白僵菌、綠僵菌、蠟蚧輪枝菌、蟲瘟霉等。白僵菌和化學殺蟲劑共同使用，可以提高防治效果，降低化學殺蟲劑對環境的影響[16]。我國利用白僵菌在早春和梅雨季節防治松毛蟲防效可達90%以上。綠僵菌是蝗蟲、蚱蜢的一種很重要的天然寄生菌。以綠僵菌為主的微生物殺蟲劑噴灑蝗蟲或蚱蜢，14～20d死亡率達到70%～90%，而對其它非目標害蟲無害[17]。我國已經嘗試利用引誘劑和無紡布菌條結合防治林區害蟲。在防治中為了提高防治效果，經常和一些化學殺蟲劑進行混用，邱國森等以45g/hm2的白僵菌孢粉與225g/hm2的25%滅幼脲3號粉劑比例混合防治馬尾松毛蟲，當代蟲口減退率達98%以上，并具有持續作用[18]。

1.5 育種工作研究

為了保持和獲得高產、高毒菌株，不僅要注意采用合適的培養條件，而且要用各種手段對菌種進行改造，獲得具有優良特性的菌株。目前蟲生真菌的育種工作主要采用以下幾種方法獲得優良菌株：①自然選育：菌種的自然選育方法在蟲生真菌的育種工作中仍然經常被采用。②誘變育種：誘變育種是采用物理的或化學的誘變因子處理微生物細胞，提高基因突變的頻率，再通過合適的篩選方法獲得所需要的優質菌種的育種方法。③準性生殖：真菌的遺傳體制基本和其他真核生物相同，但真菌也有其特殊的遺傳方式，如異核現象、準性生殖、布勒現象等。④原生質體技術：20世紀70年代以來，原生質體技術發展很快，特別是在細胞遺傳學和雜交育種中受到極大的重視。⑤基因工程技術：利用基因工程技術，即有目的地向生產菌株中插入一至多個基因，是改造蟲生真菌有效的方法[19]。

2 展望

蟲生真菌在真菌的5個亞門中均有分布，而且隨著環境污染的加重，人類環保意識的增強，生物防治顯得尤為重要。蟲生真菌對人類、環境和非靶標生物的安全性是考慮利用蟲生真菌的一個重要原因。未來的研究還需要通過基因工程改造提高蟲生真菌的環境穩定性，以獲得高效、穩定的工程菌株，從而提高真菌殺蟲劑的市場份額，為綠色農業服務。為了可以更好的為我們服務，可以從以下幾個方面深入的研究蟲生真菌[20]：①對蟲生真菌的資源進一步調查；②選育抗性高毒力菌株，先用適當的劑型；③產品規范化；④加強昆蟲流行病的系統研究；⑤加強蟲生真菌基因工程技術的方面的研究。