MMP-2 mRNA在肺癌胸膜組織、胸腔積液中的表達及臨床意義

張美寶，王強，托爾拉，韓志剛

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊 830000)

惡性胸腔積液是晚期多種惡性腫瘤胸膜轉移常見并發癥，嚴重影響腫瘤患者的生活質量，其出現往往提示患者預后不良[1]。基質金屬蛋白酶(MMPs)屬于鋅離子依賴性蛋白水解酶家族，其主要功能是降解細胞外基質，參與胚胎發育、組織重建、腫瘤轉移等多種生理和病理過程[2,3]。基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)是MMPs家族中重要成員之一。近年來研究[4]發現，MMP-2在肺癌、乳腺癌、胃癌等多種人類惡性腫瘤中呈高表達，且與惡性腫瘤不良預后有關，提示其與腫瘤侵襲轉移和增殖密切相關。關于MMP-2 mRNA在肺癌胸膜轉移中的作用研究，目前國內外相關報道較少。本研究觀察了MMP-2 mRNA在肺癌胸膜組織、胸腔積液中的表達變化，并探討其與肺癌臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取新疆醫科大學附屬腫瘤醫院2015年1月～2017年4月收治的175例胸腔積液患者，經病理確診為肺癌性90例、結核性48例、炎性37例。肺癌性胸膜病變患者中男46例，女44例；年齡29～78歲，≥60歲者38例，<60歲者52例；組織學類型：腺癌62例，鱗癌28例；分化程度：低分化54例，中、高分化36例；49例有淋巴結轉移；42例有EGFR基因突變。結核性胸膜病變患者中男26例，女22例；年齡31～75歲。炎性胸膜病變患者37例，其中男23例，女14例，年齡35～72歲。三者性別構成比、年齡等基線資料比較，差異無統計學意義。以上患者均經內科胸腔鏡行壁層胸膜活檢術明確病理診斷并留取胸腔積液標本。胸膜組織、胸腔積液標本均在離體5 min內迅速放入液氮中冷凍，后置于-80 ℃的冰箱內保存待檢。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；FastQuant RT Kit (With gDNase)購自大連寶生物工程有限公司；SYBR Select Master Mix購自德國Qiagen公司；核酸蛋白定量儀購自北京凱奧公司；臺式高速冷凍離心機購自上海力新公司；MMP-2 mRNA及內參引物由烏魯木齊歐易生物醫學科技有限公司合成。

1.3 MMP-2 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。用TRIzol試劑盒從胸膜組織或胸腔積液中提取總RNA，核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，按照FastQuant RT Kit (With gDNase)逆轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，得到的cDNA可用于后續實驗或低溫保存。利用SYBR Select Master Mix試劑盒進行PCR擴增。以β-actin為內參基因，設計并合成引物。PCR反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min循環40次。以2-ΔΔCt法計算組織及胸腔積液中MMP-2 mRNA相對表達量，實驗重復3次取平均值。

2 結果

2.1 三者胸膜組織中MMP-2 mRNA表達比較 肺癌性、結核性、炎性胸膜組織中MMP-2 mRNA相對表達量分別為1.767±0.591、1.038±0.250、0.990±0.074，前者與后兩者相比P均<0.05，后兩者相比P>0.05。

2.2 三者胸腔積液中MMP-2 mRNA表達比較 肺癌性、結核性、炎性胸腔積液中MMP-2 mRNA相對表達量分別為1.648±0.389、1.029±0.284、1.012±0.088，前者與后兩者相比P均<0.05，后兩者相比P>0.05。

2.3 肺癌胸膜組織與胸腔積液中MMP-2 mRNA表達的關系 肺癌胸膜組織與胸腔積液中MMP-2 mRNA的表達呈正相關(r=0.839，P<0.05)。

2.4 MMP-2 mRNA表達與肺癌臨床病理參數的關系 見表1。

表1 MMP-2 mRNA表達與肺癌臨床病理參數的關系

3 討論

胸腔積液是臨床常見并發癥之一。在我國，結核性胸膜炎和腫瘤是引起胸腔積液的主要原因[5]。結核性胸膜炎是肺外結核最常見表現形式，是全球許多國家結核性胸腔積液形成的主要原因[6]。幾乎所有胸膜腫瘤均會出現惡性胸腔積液，病理類型以腺癌最為常見，男性以肺癌胸膜轉移腫瘤最為常見，女性以乳腺癌居多。惡性胸腔積液的產生通常提示腫瘤預后欠佳[7]。因此，探討腫瘤胸膜轉移發生發展機制，尋找腫瘤胸膜轉移治療潛在靶點具有重要意義。

惡性腫瘤侵襲和轉移是一涉及多種基因及其產物共同參與調控的復雜過程，MMPs在此過程中起著重要作用。MMP-2基因位于人類染色體16q21上，由13個外顯子和12個內含子組成，結構基因總長度為27 kb。MMP-2被激活后形成的Ⅳ型膠原酶，一方面通過介導細胞外基質和基底膜降解突破基質屏障，促使瘤細胞沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤，促進腫瘤侵襲與轉移，一方面還可通過水解血管基底膜蛋白，破壞細胞與細胞外基質，增加內皮細胞和腫瘤細胞的遷移擴增，刺激新生血管生成，增加血管通透性，實現腫瘤浸潤和擴散[8]。

已有研究報道，MMP-2在肺癌[9]、乳腺癌[10]、胃癌[11]等人類多種惡性腫瘤組織中呈高表達。目前MMP-2在肺癌胸膜轉移過程中的作用，國內外少有報道。腫瘤細胞的生長和轉移與腫瘤血管的營養作用密切相關。MMP-2在微血管數目較多的腫瘤組織中表達高于微血管數目較少的組織。研究[12]報道，在腫瘤細胞中通過RNA干擾下調MMP-2表達，可抑制整合素αVβ3和PI3K/Akt信號傳導通路介導的VEGF表達，導致腫瘤細胞增殖活性明顯降低。提示MMP-2可通過調控VEGF表達，共同參與腫瘤增殖分化過程。推測MMP-2與VEGF在促進肺癌胸膜轉移發生、發展中可能具有協同作用。本研究結果顯示，MMP-2 mRNA在肺癌、結核性、炎性胸膜組織及胸腔積液中均有所表達，且肺癌高于結核性、炎性胸膜組織及胸腔積液。Zhang等[13]也發現，MMP-2 mRNA在乳腺癌組織中的表達量明顯高于正常乳腺組織。MMP-2在肺癌胸膜組織及胸腔積液中過表達，增加了血管內皮細胞和腫瘤細胞的遷移擴增，刺激了新生血管的形成，增加了癌細胞間的黏附能力，從而促進了肺癌胸膜轉移。有研究指出，上皮間質轉化參與腫瘤發生發展過程。已有研究[14]證實，STAT3信號活化通過調節E-鈣黏素的表達介導腫瘤的上皮間質轉化。MMP-2作為STAT3下游靶基因，一旦被激活，高表達于癌細胞中，可直接與STAT3因子結合，激活STAT信號通路，介導上皮間質轉化，下調細胞間連接結構，減少細胞間相互作用，調控腫瘤細胞的增殖分化，抑制細胞凋亡，促進肺癌細胞向胸膜浸潤與轉移。可見，抑制癌組織中MMP-2的表達，可能會減慢腫瘤的生長速度，為肺癌胸膜轉移的潛在靶點治療提供新思路。

研究[15]發現，MMP-2與新生淋巴管密切相關。MMP-2高表達的腫瘤細胞可能更易突破血管壁和淋巴管壁，通過降解細胞外基質，增強淋巴管內皮細胞增殖和遷移，促進淋巴管新生，實現腫瘤淋巴結轉移。本研究發現，MMP-2 mRNA在肺癌胸膜組織、胸腔積液中的表達水平同腫瘤淋巴結轉移、分化程度有關，隨著分化程度降低、淋巴結轉移的發生，MMP-2 mRNA表達上升。與Ma等[16]在胃癌中的研究類似。提示MMP-2 mRNA過表達與腫瘤的侵襲轉移能力密切相關。此外，本研究結果還顯示，MMP-2 mRNA在肺腺癌胸膜組織及胸腔積液中的相對表達量高于鱗癌，說明MMP-2 mRNA在肺癌胸膜轉移中具有組織學特異性。本研究通過分析還發現，腫瘤胸膜組織與對應的胸腔積液MMP-2 mRNA的表達呈正相關。提示惡性胸膜組織與胸腔積液中MMP-2 mRNA的表達具有一致性，這可能是因為胸腔積液中的有核細胞均來自同一個體，遺傳特征相同。由此推測，胸腔積液中MMP-2 mRNA表達能夠在一定程度上反映其在腫瘤胸膜組織中的表達水平。

綜上所述，MMP-2 mRNA在肺癌胸膜組織和胸腔積液中高表達，且與分化程度、淋巴結轉移和組織學類型有關，提示MMP-2 mRNA在肺癌胸膜轉移中可能扮演癌基因作用，甚至有可能成為肺惡性腫瘤胸膜轉移治療的潛在靶點，但具體機制還有待進一步闡明。

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