胸水、血液EGFR基因突變檢測在非小細胞肺癌治療中的應用價值

黃健，王于理，代平，孟娟娟，李晶，馬曉平，鞏平

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832000)

非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]，發現時多數患者已是晚期，失去手術機會，且放化療效果難盡人意。隨著腫瘤學的飛速發展，分子靶向治療備受關注，其中表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)對EGFR基因突變陽性的NSCLC患者有著顯著的療效。經EGFR-TKI治療后，EGFR基因有二次突變產生獲得性耐藥的情況，其中T790M突變較多見[2,3]，因此EGFR基因突變狀態的檢測顯得尤為重要。然而，臨床上組織樣本取材困難，二次取材活檢更是無法實現。外周血及胸水是一種存在于實性腫瘤組織外，可用于EGFR基因檢測的腫瘤成分[4～6]。本研究分析了NSCLC患者胸水及血液中EGFR基因突變檢測結果，為指導NSCLC的靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2016年2月～2017年6月石河子大學醫學院第一附屬醫院初診的40例NSCLC患者的胸水及血液標本，所有患者經組織病理證實明確EGFR基因是否突變并伴惡性胸水，其中EGFR基因突變陽性26例、陰性14例。同時收集21例經EGFR-TKI靶向治療耐藥后的患者胸水及血液標本。本研究經醫學倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 胸水及血液中EGFR基因檢測 取胸水樣本30 mL，3 000 r/min，室溫離心10 min，收集細胞沉淀，如沉淀量不夠可反復離心收集，將樣本于-80 ℃保存備用。按QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒說明書，提取胸水細胞DNA。采集患者前臂靜脈血6 mL，置于1.5 mL離心管內，3 000 r/min離心10 min取上清液，于-80℃保存備用。按QIAam Blood Mini Kit試劑盒說明書提取血清游離DNA。利用紫外線分光光度計檢測各樣本DNA的濃度和純度，確保A260/280值為1.8～2.0。將樣本的DNA按照人類ADx-EGFR基因突變檢測試劑盒說明書對所有標本進行21種已知突變的檢測。待測樣本DNA濃度調整為1～3 ng/μL。用ABI7500實時熒光PCR儀進行檢測。按照試劑盒說明書提供的判讀原則，確定標本EGFR基因突變狀態。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，采用χ2檢驗分別比較胸水、外周血標本與組織標本EGFR基因突變率的差異，胸水與外周血標本EGFR基因突變率的差異。P<0.05為差異有統計學意義。Kappa>0.75為一致性好，0.4≤Kappa≤0.75為一致性良好，Kappa小于0.4為一致性差。

2 結果

NSCLC患者胸水中EGFR基因突變23例(57.5%)，與組織中EGFR基因檢測結果比較見表1。血液中EGFR基因突變陽性13例(32.5%)，與組織中EGFR基因檢測結果比較見表2。胸水與血液中EGFR基因檢測結果比較見表3。胸水標本檢測NSCLC患者EGFR基因突變的靈敏度為88.46%，特異度為100%，約登指數為0.885；血液標本檢測NSCLC患者EGFR基因突變的靈敏度為50.00%，特異度為100%，約登指數為0.500。

表1 胸水與組織中EGFR基因檢測結果比較(例)

表2 血液與組織中EGFR基因檢測結果比較(例)

表3 胸水與血液中EGFR基因檢測結果比較(例)

在21例EGFR-TKI治療耐藥患者的胸水和血液樣本中，胸水中檢出14例T790M基因突變，突變率為66.7%(14/21)；其中2例由19外顯子缺失變成野生型，1例由L858R變成野生型，4例未檢出EGFR基因二次突變。血液中檢出11例T790M突變，突變率為52.4%(11/21)；有4例胸水檢出T790M二次突變而血液檢測為陰性，另外1例血液檢出T790M二次突變而胸水未檢出二次突變，其他結果與胸水一致。

3 討論

EGFR基因位于第7號染色體短臂上，包含28個外顯子，大小約170 kD。有研究[7～9]表明，EGFR-TKI可明顯提高EGFR基因突變陽性NSCLC患者的無疾病進展生存期及總生存期，其中19外顯子缺失突變及21外顯子L858R點突變明顯提高了與抑制劑的結合能力，因此檢測EGFR基因突變狀態是EGFR-TKI靶向治療的關鍵所在。對于晚期NSCLC無法獲取組織活檢的患者而言，急需尋求新的替代樣本進行基因檢測。大量研究表明，組織DNA和循環DNA一致性較好，胸水是晚期肺癌常見并發癥，含有正常細胞和腫瘤細胞，取樣方便、創傷小。美國胸科醫師學會循證臨床實踐指南[10]指出，胸水細胞學診斷敏感性平均為63%。Liu等[11]研究發現，胸水細胞塊與組織樣本的一致率為81%。外周血循環DNA是腫瘤細胞凋亡和壞死后游離于血漿中的DNA片段，其含量和基因狀態與腫瘤進展相關。我們課題組前期實驗[4]結果發現，血清與組織EGFR基因突變狀態的檢測一致性良好。因此，胸水和外周血均有可能成為基因檢測的新途徑。本課題結果顯示，胸水測EGFR基因突變狀態與組織對比一致率為92.50%(Kappa=0.843)，一致性極好；而血液測EGFR基因突變狀態與組織對比一致率良好，為67.50%(Kappa=0.412)。因此，我們認為對無法獲取組織活檢的NSCLC患者，胸水及血液可替代組織成為新的EGFR基因檢測途徑。

另外，血液與胸水檢測結果共同陽性13例，共同陰性17例，胸水陽性而血液陰性有10例，兩種標本相對比，血液標本檢測結果一致率明顯低于胸水標本，差異有統計學意義，其靈敏度和約登指數也較低。導致這種差異的原因，可能與血液中ctDNA片段較短、濃度較低、腫瘤分期以及標本處理技術等多種因素有關。由此表明，胸水檢測EGFR明顯優于血液標本;在晚期肺癌患者中，若伴有惡性胸水時，優先選擇胸水檢測EGFR基因突變狀態。血液標本同時檢測可增加EGFR基因的檢出率，但仍需進一步研究和探索胸水和血液檢測EGFR基因狀態的關鍵技術，以提高其檢測的靈敏度和檢出率，這對在臨床開展和實施對肺癌患者的早期篩查、診療以及EGFT-TKI治療后隨訪具有重要的臨床意義。

研究表明，多數EGFR基因突變陽性的晚期NSCLC患者在使用EGFR-TKI治療9～13個月后會出現獲得性耐藥。Honda等[12]發現，EGFR基因狀態在靶向治療過程中發生改變的情況可能是獲得性耐藥機制之一。有研究[13,14]對EGFR基因敏感突變患者經EGFR-TKI治療耐藥后的二次活檢分析發現，T790M基因突變率較高，初步表明T790M基因突變是EGFR-TKI獲得性耐藥的重要機制之一。隨著分子靶向治療的不斷發展，有Ⅱ期臨床試驗[15]證實，相對于其他耐藥機制而言，目前針對T790M突變陽性患者研發的第三代EGFR-TKI藥物具有較好的客觀緩解率、安全性和延長進展后生存期。因此，盡早發現EGFR-TKI治療后的患者是否出現EGFR基因二次突變情況，成為目前靶向治療的一個新熱點。本研究通過ADx-ARMS法檢測21例EGFR-TKIs治療耐藥患者的胸水和血液樣本，胸水中檢出14例T790M基因突變，血液中檢出11例T790M突變;有4例胸水檢出T790M二次突變而血液檢測為陰性，另外1例血液檢出T790M二次突變而胸水未檢出二次突變，兩種樣本的其他檢測結果一致。血液檢出T790M突變而胸水未檢出的情況，可能與腫瘤異質性相關。由于腫瘤的異質性廣泛存在，瘤內不同癌細胞亞群、原發灶與轉移灶間均存在一定差異，均可導致EGFR基因檢測結果出現偏差。

可見，利用胸水及血液標本具有微創、方便快捷的特點，多次、多時段、多種樣本動態監測EGFR基因突變狀態，降低腫瘤異質性以及檢測技術造成的假陽性和偏差，同時可以及時檢測出EGFR基因是否發生耐藥突變。相對于影像學及腫瘤標記物評估結果而言，該法能更早地預測和評估治療后耐藥情況，從而個性化指導治療耐藥后晚期NSCLC患者的靶向治療。

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