肺鱗癌患者血清25羥維生素D水平及其與氧化應激、DNA損傷的關系

謝雅麗，李國平

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000；2成都市第三人民醫院)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其病死率居惡性腫瘤首位。研究[1]發現，氧化應激與DNA損傷可能參與了肺癌的發生發展。近年來有研究[2]發現，25羥維生素D有減輕哮喘患者體內氧化應激的作用,并且與慢性阻塞性肺疾病、肺部感染等多種呼吸系統疾病相關,且25羥維生素D對甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、宮頸癌等腫瘤也有明顯的保護作用，但目前在肺鱗癌中研究較少。本研究觀察了肺鱗癌患者血清25羥維生素D水平，并探討其與氧化應激、DNA損傷的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年4月～2017年4月于西南醫科大學附屬醫院呼吸內科就診的肺鱗癌患者60例作為實驗組，其中男31例、女29例，年齡(50±5)歲，每天吸煙≥20支，持續時間均在20年以上。所有患者通過胸部CT及病理學證實為肺鱗癌，TNM分期均為Ⅳ期，就診前均未進行過任何治療，并排除近期感染及其他疾病因素。選取同期健康體檢者30例作為對照組，其中男16例、女14例，年齡(51±4.5)歲。兩組性別、年齡相比差異均無統計學意義。兩組近期均未服用過維生素D相關制劑。本研究經我院醫學倫理學委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 血清25羥維生素D檢測 在清晨空腹狀態下采集兩組靜脈血3 mL。所有標本均在采集后室溫放置30 mim，2 500 r/min離心15 min。收集上清液，采用ELISA法測定兩組血清25羥維生素D水平，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3 氧化應激指標檢測

1.3.1 細胞內氧化應激指標H2O2、超氧陰離子檢測 用肝素抗凝管采集兩組靜脈血4 mL，采用密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(PBMC)，顯微鏡下細胞計數，至少達1×106/mL。采用2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、二氫乙啶(DHE)探針測定細胞內活性氧，DCFH-DA探針檢測細胞內H2O2，DHE探針檢測細胞內超氧陰離子。檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，避光狀態下嚴格按照試劑盒說明書進行操作。最后上流式細胞儀檢測，測定各個樣本細胞內DCF及DHE的平均熒光強度，每個樣本至少分析1×105個PBMC。數據使用FlowJo Software分析。

1.3.2 血清氧化應激指標超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量檢測 在清晨空腹狀態下，采集兩組靜脈血3 mL。所有標本在采集后室溫放置30 mim，2 500 r/min離心15 min，用移液器吸取分離的血清至EP管中，保存至-80 ℃冰箱，待標本收齊后統一測定。采用黃嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸法(TBA法)分別檢測血清SOD活力及MDA含量，SOD及MDA試劑盒均購自南方建成生物公司，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4 DNA損傷指標γ-H2AX檢測 兔γ-H2AX(Ser139)單克隆抗體購自美國Abcam公司。用肝素抗凝管采集兩組靜脈血4 mL，采用密度梯度離心法提取PBMC，顯微鏡下細胞計數，至少達1×106/mL。用2%多聚甲醛1 mL室溫下固定60 min，PBS洗滌，0.2% Triton X-100 1 mL透膜15 min，PBS洗滌，1% BSA(胎牛血清)37 ℃下封閉30 min，PBS洗滌，室溫下一抗(γ-H2AX)孵育30 min，PBS洗滌，室溫下二抗(FITC-羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司)避光孵育30 min，PBS洗滌，最后制成400 μL的PBS懸液，上流式細胞儀檢測。測定樣本細胞內γ-H2AX水平(DNA損傷率)及γ-H2AX平均熒光強度，每個樣本至少分析1×105個PBMC。數據使用FlowJo Software分析。

2 結果

2.1 兩組血清25羥維生素D水平比較 實驗組、對照組血清25羥維生素D水平分別為(19.42±6.45)、(56.08±15.16)ng/mL，兩組相比P<0.05。

2.2 兩組氧化應激指標比較 結果見表1。

表1 兩組氧化應激指標比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.3 兩組DNA損傷指標比較 實驗組、對照組γ-H2AX水平分別為37.91%±16.55%、3.51%±1.16%，平均熒光強度分別為8.74±1.98、3.63±0.60，兩組相比P均<0.05。

2.4 實驗組血清25羥維生素D與氧化應激及DNA損傷指標的相關性 實驗組血清25羥維生素D水平與H2O2、超氧陰離子、MDA含量、γ-H2AX水平、γ-H2AX平均熒光強度均呈負相關(r分別為-0.78、-0.72、-0.46、-0.66、-0.64，P均<0.05)，與SOD活力呈正相關(r=0.62，P<0.05)。

3 討論

25羥維生素D由維生素D轉換而來，在人體內具有重要的生物活性。有研究[3,4]指出，25羥維生素D不僅可調節體內鈣磷代謝，還對自身免疫、神經系統及內分泌系統等具有調節作用。Graziano等[5]研究發現，25羥維生素D能保護細胞免受氧化應激損傷，是清除細胞內過氧化物的抗氧化劑，可以誘導細胞分化、抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、穩定細胞染色體結構，從而防止細胞DNA鏈的斷裂和解聚。本研究發現，實驗組血清25羥維生素D水平低于對照組，表明低水平的血清25羥維生素D可能在肺鱗癌的發生發展中起一定作用。既往研究也證實了相似的結果。Grant[6]對美國人群的研究提示，太陽紫外線輻射(增加維生素D)和肺癌病死率呈負相關。Mohr等[7]研究了多個國家的肺癌發生率，發現紫外線照射量與肺癌的發生率有關。腫瘤與25羥維生素D存在相互作用，一方面25羥維生素D的缺乏會導致腫瘤的發生，另一方面腫瘤疾病會導致患者戶外活動減少，日照時間短，使25羥維生素D合成減少[8]。這些研究均表明，25羥維生素D可能與肺鱗癌存在密切關系，25羥維生素D的缺乏可能會在一定程度上導致肺鱗癌的發生發展。

本研究發現，實驗組氧化應激指標PBMC的H2O2、超氧陰離子及血清MDA含量高于對照組，血清SOD活力低于對照組，說明實驗組的氧化應激水平高于對照組。本研究還發現，實驗組血清25羥維生素D水平與H2O2、超氧陰離子、MDA含量均呈負相關，與SOD活力呈正相關。這表明隨著肺鱗癌患者血清25羥維生素D水平的降低，其氧化應激水平明顯增強。氧化應激為中性粒細胞啟動免疫防御反應后的一種機制，其可通過多種途徑參與腫瘤的發生、發展。Deng等[9]曾指出，維生素D作為一種抗氧化劑，可保護細胞蛋白質和細胞膜免受氧化損傷，并且能減少細胞的氧化應激反應，增加其抗氧化能力。既往在哮喘相關的研究[2]中發現，25羥維生素D的缺乏會引起血清氧化型二氯熒光素(DCF)、二氫乙啶(DHE)等指標的增加，導致哮喘患者體內氧化應激的增強。25羥維生素D缺乏引起的氧化應激指標的增加，可能是導致肺鱗癌患者體內高氧化應激狀態的原因所在。

γ-H2AX被認為是一種早期檢測DNA損傷最有效的生物學標志物。本研究結果發現，實驗組PBMC的γ-H2AX水平、平均熒光強度高于對照組。表明實驗組的DNA損傷程度高于對照組。本研究結果還發現，實驗組血清25羥維生素D水平與γ-H2AX水平、平均熒光強度均呈負相關。研究結果表明，隨著肺鱗癌患者血清25羥維生素D水平的降低，其DNA損傷程度隨之增高。這可能是由于肺鱗癌患者體內低水平的25羥維生素D會降低細胞抗氧化的能力，導致DNA的氧化損傷。有研究[1]發現，活性氧的產生和細胞抗氧化能力之間嚴重失衡引起的氧化應激會導致各種類型生物大分子的損失，例如DNA、RNA、脂類、蛋白質等，活性氧對這些生物大分子的損傷最終將導致細胞的凋亡。若氧化應激作用于支氣管上皮細胞，使癌基因(如Ras基因)激活和抑癌基因(如p53、FHIT基因)失活，便會引起細胞的轉化、DNA的損傷，導致肺鱗癌的發生。目前，25羥維生素D減輕肺鱗癌的氧化應激及DNA損傷的機制尚不明確。但有研究[10]指出，25羥維生素D可以調節硫氧還原蛋白結合蛋白(TXNIP)的表達，而TXNIP是調節機體氧化應激的重要物質[11]。25羥維生素D缺乏會引起TXNIP增高，TXNIP增高一方面會抑制硫氧還原蛋白的抗氧化能力，造成活性氧的堆積及氧化應激損傷，另一方面會激活凋亡信號調節激酶1(ASK-1)相關的凋亡通路，最終導致細胞凋亡[12]，引起DNA的損傷。

因此，我們推測25羥維生素D可能與肺鱗癌的氧化應激及DNA損傷密不可分，充足的25羥維生素D可能有減輕肺鱗癌氧化應激及DNA損傷的作用，起到對肺鱗癌患者的保護作用，可預防肺鱗癌的發生發展。

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