甘草酸對缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響及機制探討

余鑫鑫，陳陽

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

甘草酸提取于植物甘草根莖部位，其分子結構中含有葡萄糖醛酸和甘草次酸，并且水溶性較好[1]。細胞和動物實驗研究結果發現，甘草酸在抗炎癥、調節氧化還原平衡、參與機體免疫調節、抗病毒感染、抑制腫瘤細胞增殖、保肝護肝等方面有顯著作用[2]。Lin等[3]研究發現，甘草酸分子中含有五環三萜結構，與糖皮質激素具有相似的藥理活性，在治療炎癥和抑制細胞凋亡方面作用較為顯著，因此在急慢性肝炎、支氣管炎及艾滋病等治療中備受青睞。細胞凋亡在心血管疾病發病機制中起關鍵的誘導作用，因此在心血管疾病治療中對心肌上層表皮細胞凋亡進行抑制可以很好地改善疾病。細胞凋亡受多個信號通路程序性調控，將信號通路中的蛋白作為藥物治療靶點，可對相關通路進行抑制，進一步抑制細胞凋亡的發生，改善心臟功能[4]。2016年2～4月，本研究觀察了甘草酸對缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 健康成年雌性SD大鼠50只，體質量230～260 g，由巴菲爾生物技術有限公司提供。甘草酸(Sigma公司，≥99%)；細胞凋亡原位檢測試劑盒(Roche公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(巴菲爾生物技術有限公司)；兔抗鼠絲分裂原活化蛋白激酶4/7(MKK4/7)、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、磷酸化MKK4/7(p-MKK4/7)、磷酸化JNK1/2/3(p-JNK1/2/3)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)8、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Caspase-3單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，二抗羊抗兔IgG購自美國LI-COR Biosciences公司；電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；輪轉式石蠟切片機(浙江金華益迪醫療設備廠)。

1.2 動物分組、造模及用藥處理 將大鼠隨機分為假手術組、模型組及甘草酸低、中、高劑量組5組，各10只。后四組制備缺血/再灌注大鼠模型，構建方法借鑒Zhang等[5]方法。具體方法如下：大鼠術前禁食24 h，正常飲水。稱重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切開大鼠頸部，分離左側頸動脈，行頸動脈置管。開胸并打開心包，使心臟充分暴露，在左心耳下1～2 cm處用真絲線穿過心臟表層，結扎左冠狀動脈降支，引起心肌缺血，半小時后松開結扎，使缺血冠狀動脈再灌注24 h。關閉胸腔，縫合后注射青霉素防止感染。缺血大鼠模型構建的評價標準是左心室前壁紫紺及同步心電圖Ⅱ導聯ST段增高，再灌注模型構建評價標準是紫紺逐漸紅潤及ST段降低1/2，同時滿足上述兩種情況標志著構建的缺血/再灌注大鼠模型成功。假手術組與模型組手術前處理相同，但只穿線不結扎左冠狀動脈降支。甘草酸低、中、高劑量組在缺血前半小時分別股靜脈注射30、60、90 mg/kg的甘草酸，假手術組與模型組注射同體積生理鹽水。在灌注結束后，低溫條件下迅速剪下各組大鼠心臟，根據后續實驗對組織進行不同的處理。

1.3 心肌細胞凋亡率測算 采用TUNEL法。將各組心肌組織放入二甲苯中脫蠟5～10 min，再次更換新鮮二甲苯繼續脫蠟5～10 min后，加入無水乙醇洗去二甲苯，滴加不含DNase的蛋白酶K，20～30 ℃作用半小時后，PBS洗滌3次，加入含0.1%的Tgiton X-100的PBS，冰浴2 min，然后置于熒光顯微鏡下觀察。根據陽性凋亡心肌細胞的分布情況，每個標本捕獲10個視野，記錄每個視野40個細胞中的凋亡細胞數，計算各組心肌細胞凋亡率。

1.4 心肌組織中MKK/JNK信號通路及凋亡蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組大鼠心肌組織，剪碎放入RIPA裂解液中進行碾磨提取蛋白。利用BCA試劑盒操作說明檢測所提取蛋白濃度，計算上樣體積。向蛋白液中加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液，充分混勻后于100 ℃變性10 min。每孔加樣量蛋白為25 μg，根據所檢測目的蛋白分子量配制10%的SDS-瓊脂糖凝膠。電泳過程中，濃縮膠電泳時電壓控制在70 V，分離膠電泳時電壓控制為120 V；待電泳完成后，在275 mA條件下轉膜60 min；完成后將膜浸泡于5%脫脂奶粉中封閉1 h，洗膜，將條帶放入MKK4/7、p-MKK4/7、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、Caspase-8、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗中4 ℃孵育過夜；再常溫下孵育HPR標記的羊抗兔二抗1 h，TBST洗膜3次。用Odyssey雙色紅外激光成像系統掃膜分析蛋白表達水平。

1.5 心肌組織病理學觀察 收集各組大鼠心肌組織，經甲醛固定、石蠟包埋、制成切片后，先用蘇木精液染色5 min，經過多次洗滌后，再用0.5%伊紅液染色3 min，洗滌后用中性樹膠封固，光鏡下觀察心肌組織病理改變。

2 結果

2.1 各組心肌細胞凋亡率比較 假手術組、模型組、甘草酸低劑量組、甘草酸中劑量組、甘草酸高劑量組細胞凋亡率分別為2.34%±0.62%、28.53%±1.95%、23.27%±1.58%、16.27%±1.49%、8.92%±1.87%，假手術組與模型組相比，后四組兩兩相比，P均<0.05。

2.2 各組心肌組織中MKK/JNK信號通路蛋白表達比較 結果見表1。

表1 各組心肌組織中MKK/JNK信號通路蛋白表達比較

注：與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與甘草酸低劑量組相比，cP<0.05；與甘草酸中劑量組相比，dP<0.05。

2.3 各組心肌組織中凋亡蛋白表達比較 結果見表2。

表2 各組心肌組織中凋亡蛋白表達比較

注：與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與甘草酸低劑量組相比，cP<0.05；與甘草酸中劑量組相比，dP<0.05。

2.4 各組心肌組織病理學觀察結果 假手術組大鼠心肌纖維正常、細胞排列分布均勻、細胞飽滿、細胞結構清晰可見，細胞中未發現水腫、變性壞死及炎性細胞浸潤。模型組大鼠心肌細胞排列雜亂無章，出現較多變性壞死細胞，細胞水腫，胞核明顯皺縮，還出現較多炎性細胞浸潤。甘草酸低、中劑量組心肌纖維細胞排列雜亂無章，心肌細胞部分出現水腫、空泡，偶爾可見點狀壞死，細胞水腫及炎性細胞較少。甘草酸高劑量組大鼠心肌細胞排列規則整齊，細胞分布均勻，心肌纖維完整性較好，存在輕度間質水腫，還可見少許炎性細胞浸潤。

3 討論

甘草酸具有廣泛的藥理活性，在臨床上的應用也較為廣泛。基礎研究發現，甘草酸可以抑制艾滋病病毒增殖，誘導多種腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，還介導機體免疫調節等。與此同時，學者對甘草酸藥理作用的相關研究越來越多，對其藥理活性及作用機制也不斷深入，促使甘草酸的應用領域不斷擴大。于是，本文研究了甘草酸對缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響，并對其作用機制進行了初步研究。

本研究結果發現，與假手術組相比，模型組細胞凋亡率高、Caspase-8表達高、Bax表達高、Caspase-3表達高、Bcl-2表達低，與模型組相比，甘草酸中劑量組及甘草酸高劑量組細胞凋亡率低、Caspase-8表達低、Bax表達低、Caspase-3表達低、Bcl-2表達高。缺血/再灌注會引起心肌細胞凋亡的發生，可能是由于缺血/再灌注引發的缺血缺氧導致心肌組織氧化應激損傷，氧自由基的過度累積會激活炎性因子的釋放；多種炎癥因子會通過作用膜上相關受體，促使NF-κB向細胞核內的轉移，誘導多種促凋亡基因(Caspase-8、Bax、Caspase-3)的表達[6,7]。促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2比例發生失衡，導致細胞凋亡的發生[8]。甘草酸可以抑制心肌細胞因缺血/再灌注所引起的凋亡，對心肌細胞起到一定的保護作用。同樣本研究采用HE染色法發現甘草酸劑量依賴性地減輕心肌組織損傷的病理形態學變化。

為了進一步研究甘草酸通過何種信號通路來抑制心肌細胞的凋亡，我們采用了免疫印跡方法檢測了細胞內凋亡相關蛋白的表達。缺血/再灌注會引起氧化應激損傷，進一步導致炎性因子分泌增加。早期也有研究報道，JNK通路可被多種細胞因子(如TNF-α、IL-6、EGF等)、應激(如紫外線、電離輻射、氧化應激等)以及某些G蛋白偶聯受體激活，參與機體組織細胞的凋亡與壞死[9]。程軍等[10]認為，JNK信號通路參與細胞凋亡，在缺血/再灌注損傷的病理變化過程中起重要作用，與缺血/再灌注損傷存在高度的相關性。同樣，本研究發現模型組p-MKK4/7、p-JNK1/2/3表達水平高于假手術組。缺血/再灌注大鼠MKK4/7/JNK1/2/3信號通路處于高度活化的狀態，進而誘導了凋亡相關蛋白水平的改變，導致心肌細胞凋亡的發生。與模型組相比，甘草酸中劑量組及甘草酸高劑量組p-MKK4/7、p-JNK1/2/3表達低。由此可見，甘草酸可抑制MKK4/7和JNK1/2/3蛋白的磷酸化水平，進而減少心肌細胞凋亡的發生。

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