Gli抑制劑GANT61對食管腺癌OE33細胞凋亡的誘導作用

杜媛鯤，廖海江，陳閣，張耀中，米源，王雷

(1河北醫科大學第四醫院，石家莊 050011；2河北醫科大學期刊社)

食管癌主要包括食管鱗狀細胞癌和食管腺癌，總體發病率名列全球第八。目前，我國的食管癌發病率以食管鱗狀細胞癌為主，但隨著生活水平的提高，食管腺癌的發病率呈上升趨勢[1]。手術和放化療等不能顯著提高中晚期食管腺癌患者5年生存率，因此深入探索食管腺癌發生發展的分子學機制對于防治患者的復發轉移意義重大。近年研究表明，Hh信號傳導通路的異常激活與肝癌[2]、乳腺癌[3]、基底細胞癌[4]和急性粒細胞性白血病[5]的發生發展密切相關，在腫瘤細胞的生長增殖以及轉移過程中發揮重要作用。有研究[6,7]發現，GANT61作為特異性針對Hh通路核心靶點Gli1和Gli2的抑制劑，在多種腫瘤治療中展示了較好的抗腫瘤活性。本研究使用GANT61特異性下調人食管腺癌OE33細胞系Gli(Gli1、Gli2)的表達，探討Gli表達和食管腺癌細胞凋亡的關系，以期為食管腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管腺癌細胞系OE33，RPMI1640培養液，GANT61，Mini-PROTEAN TGX預制膠，兔抗人Gli1多克隆抗體，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體，兔抗人GAPDH單克隆抗體，鼠抗人Gli2單克隆抗體，兔抗人c-myc單克隆抗體，Pierce-BCA蛋白分析試劑盒，小型Trans-Blot?轉印槽，Epics-XL型流式細胞測定儀，M-PER細胞總蛋白提取試劑。

1.2 細胞培養及分組 將食管腺癌OE33細胞置于37 ℃、5% CO2環境下培養。培養傳代所用的培養液為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640。用PBS洗滌生長狀態良好的OE33細胞，胰酶消化，收集細胞并離心，行細胞計數后按照3×105/孔細胞數鋪于6孔板上，待細胞培養至70%～80%融合生長狀態良好時更換為含2%胎牛血清的培養基。將細胞分為對照組、實驗一組、實驗二組，分別用0、10、20 μmol/L濃度的GANT61處理24 h。

1.3 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。取上述3組細胞用PBS液洗滌細胞3次，胰酶消化，收集細胞后用70%乙醇固定每組樣本，制備成單細胞懸液，50 μg/mL PI染液4 ℃染色，冰上避光，應用流式細胞儀檢測每組樣本的熒光強度。采用Expo32ADC進行每組樣本的免疫熒光數據分析，計算每組樣本細胞的凋亡率。實驗重復3次。

1.4 各組細胞Gli1、Gli2、c-myc、Bcl-2蛋白檢測 采用Western blotting法。用PBS沖洗上述3組細胞后，每孔加M-PER培養細胞總蛋白提取試劑100 μL，用刮匙收集每組樣本細胞的總蛋白提取液，BCA法測定每組樣本細胞的總蛋白濃度。在Mini-PROTEAN TGX預制膠中以每道10 μg蛋白上樣，在200 V、40 min的反應條件下經Tris/甘氨酸/電泳緩沖液SDS進行電泳。100 V、40 min實驗條件下冰水浴將蛋白轉移到PVDF膜上。TBST液洗膜3次，每次10 min，再用5%脫脂奶粉/TBST液封閉PVDF膜1 h后加一抗工作液，工作濃度Gli1為1∶1 000，Gli2為1∶250，Bcl-2為1∶1 000，c-myc為1∶1 000，GAPDH為1∶40 000，4 ℃過夜。第2天更換二抗前后各用TBST洗膜3次，每次10 min，二抗羊抗兔或羊抗鼠工作濃度均為1∶10 000，室溫孵育1 h。于膜上加ECL試劑顯色5 min后于暗室X線曝光顯影，顯影條帶用Image軟件進行分析。實驗重復3次。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較 實驗一組、實驗二組、對照組細胞凋亡率分別為16.12%±1.52%、25.62%±0.93%、2.74%±0.34%，兩兩相比P均<0.01。

2.2 各組細胞Gli1、Gli2、c-myc、Bcl-2蛋白表達比較 見表1。

表1 各組細胞Gli1、Gli2、c-myc、Bcl-2蛋白表達比較

注：與對照組相比，*P<0.01；與實驗一組相比，#P<0.01。

3 討論

腫瘤的發生和發展包括細胞的異常增殖和凋亡受抑制，深入研究細胞凋亡的機制和誘導腫瘤細胞凋亡具有重要的臨床價值和理論意義。Hh信號轉導通路由上游Shh配體、PTCH和Smo組成的受體復合物、下游核轉錄因子Gli蛋白家族以及多種靶基因等構成，從而調控腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡。Hh信號通路可在多個點位上發生突變并最終形成腫瘤，其中Gli是Hh信號通路的核轉錄子，位于信號轉導的樞紐位置，發揮著Hh通路調節器的作用。研究[8,9]表明，Gli1和Gli2表達上調代表Hh信號通路的激活，在細胞的自我更新和凋亡過程中發揮重要作用；并且有研究[10]發現，針對Gli靶點進行調控比針對上游靶點Smo具有更強的抗腫瘤作用，可以顯著抑制胸膜間皮瘤細胞的生長和轉移。因此，本實驗通過體外研究探討Gli對食管腺癌OE33細胞凋亡的影響及其可能的相關機制。

腫瘤細胞的凋亡是由細胞內多基因精確調控的過程，當細胞凋亡調控紊亂時可以導致腫瘤的發生。Bcl-2基因是細胞線粒體膜滲透性改變的內源性抑制物，能夠抑制多條凋亡信號并延長細胞壽命，與多種人類腫瘤的發生密切相關；并且有研究[11]表明，Bcl-2是Gli1和Gli2直接的轉錄靶基因。c-myc在多種腫瘤組織中高表達，在腫瘤的發生發展中與細胞周期變化、細胞惡性轉化和分化以及細胞凋亡過程中起到重要的調節作用，靶向抑制c-myc可誘導某些腫瘤細胞凋亡和抑制增殖[12,13]。本研究結果顯示，隨著GANT61藥物濃度的增高其誘導食管腺癌細胞凋亡的能力顯著增加。本研究進一步從蛋白水平探討了食管腺癌OE33細胞Gli表達和細胞凋亡與增殖的關系，結果發現GANT61不但可以呈劑量依賴性顯著下調OE33細胞的Gli1和Gli2蛋白表達，并且可以顯著下調Bcl-2和c-myc蛋白表達。分析其原因可能是，在食管腺癌組織中存在Hh/Gli通路異常激活的狀態，參與調控OE33細胞增殖與凋亡過程，GANT61可靶向特異性抑制Gli1和Gli2表達來調控下游靶基因Bcl-2的表達促進細胞凋亡，同時通過調節c-myc蛋白對腫瘤細胞的生長進行調控，最終達到抗腫瘤的目的。這與Fu等[14]研究發現GANT61可以通過增加TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5和Fas表達，下調Bcl-2、c-myc等表達抑制胰腺癌干細胞生長的研究結果相一致。表明Bcl-2和c-myc在食管腺癌發生中可能具有協同作用，在抑制腫瘤細胞凋亡的同時又促進細胞增殖，GANT61可有效降低這兩種蛋白的陽性表達，從而抑制腫瘤細胞增殖。

綜上可見，Gli抑制劑GANT61對食管腺癌OE33細胞凋亡具有誘導作用，GANT61可能是通過特異性抑制Gli1、Gli2蛋白表達，從而調節細胞中Bcl-2和c-myc蛋白表達，進而抑制腫瘤細胞生長，這為GANT61治療食管癌的應用提供了理論基礎。

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