STAT1信號(hào)通路在全反式維甲酸誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞向粒細(xì)胞分化過(guò)程中的作用與機(jī)制

孫琳琳，郭強(qiáng)，朱肖肖，張振，趙霖，魏然，施引，尹訓(xùn)強(qiáng)，張?jiān)坪纾獓?guó)勝，李霞

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250200；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

誘導(dǎo)分化是治療腫瘤的理想模式之一，我國(guó)學(xué)者首次應(yīng)用全反式維甲酸(ATRA)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)并獲得成功[1]。然而，目前ATRA誘導(dǎo)療法尚存在療效不穩(wěn)定、部分患者易復(fù)發(fā)等問(wèn)題[2]。因此，進(jìn)一步闡釋其誘導(dǎo)分化機(jī)制，將為臨床治療提供新的靶點(diǎn)與思路。研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸誘導(dǎo)的人組織細(xì)胞淋巴瘤U-937細(xì)胞分化與STAT1絲氨酸727位磷酸化密切相關(guān)[3]，但其在人急性髓系白血病細(xì)胞HL-60向粒細(xì)胞分化中的作用機(jī)制尚不明確。研究[4]發(fā)現(xiàn)，在髓系分化過(guò)程中亮氨酸結(jié)構(gòu)拉鏈轉(zhuǎn)錄因子(C/EBPs)家族具有重要作用，其中C/EBPε參與調(diào)節(jié)髓細(xì)胞中、后期的分化，并維持粒細(xì)胞的功能，過(guò)表達(dá)C/EBPε能夠促進(jìn)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)誘導(dǎo)的粒細(xì)胞分化。miR-155-5p是一種微小RNA(miRNA)，在多種實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá)升高[5～9]。2016年10月～2017年10月，我們通過(guò)建立ATRA誘導(dǎo)HL-60向粒細(xì)胞分化模型，探討STAT1信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用，并初步探討STAT1的調(diào)控機(jī)制，以期闡述ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向粒細(xì)胞分化的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HL-60購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自北京中科邁晨科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。ATRA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用DMSO配制成10 mmol/L儲(chǔ)存液，-80 ℃保存；M-MLV 購(gòu)自美國(guó)Promega公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；抗人熒光抗體PE-CD11b購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。小鼠源STAT1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔源p-STAT1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；兔源GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、抗兔IgG抗體均購(gòu)自北京中杉金橋公司；dNTP購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，RNasin購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Oligo(dT)購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；內(nèi)參照CAPDH及目的基因STAT、C/EBPε q-PCR引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成；miR-155-5p及內(nèi)參照U6逆轉(zhuǎn)錄引物與q-PCR引物由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清的IMDM完全培養(yǎng)液(20%胎牛血清、1 %雙抗)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液或傳代。

1.2.2 誘導(dǎo)分化模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，加入ATRA(2 μmol/L)，分別誘導(dǎo)24、48、72、96 h，對(duì)照組加入相同濃度DMSO。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 收集對(duì)照組及觀察組誘導(dǎo)96 h的HL-60細(xì)胞，1×PBS洗2次(700 g×7 min)，去上清，1×PBS重懸細(xì)胞，涂片，室溫干燥，瑞氏-吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 粒細(xì)胞表面特征性標(biāo)志CD11b檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集對(duì)照組及觀察組誘導(dǎo)96 h的HL-60細(xì)胞，1×PBS洗2次(700 g×7 min)，去上清；100 μL 1×PBS重懸細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入PE-CD11b抗體，4 ℃避光孵育30 min；1×PBS洗3次(700 g×7 min)，去上清；1×PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀測(cè)算CD11b陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.5 細(xì)胞STAT1、C/EBPε mRNA檢測(cè) 采用q-PCR法。收集對(duì)照組和觀察組誘導(dǎo)各時(shí)點(diǎn)的HL-60細(xì)胞，1×PBS洗2次(500 g×5 min)，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度及純度；M-MLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA，UltraSYBR Mixture PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。以2-ΔΔCt表計(jì)算STAT1及C/EBPε mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 細(xì)胞STAT1及p-STAT1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集對(duì)照組及觀察組誘導(dǎo)各時(shí)點(diǎn)的HL-60細(xì)胞，1×PBS洗2次(500 g×5 min)；加入含1% 蛋白酶抑制劑及1%蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；加入1/4體積的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，混勻后100 ℃加熱變性；12%聚丙烯酰氨凝膠電泳，硝酸纖維素轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜；1×PBST洗膜(15 min×4次)，二抗室溫孵育1 h；1×PBST洗膜(15 min×4次)，化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光成像。用Quantity one 4.6.2軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 細(xì)胞miR-155-5p檢測(cè) 采用q-PCR法。收集對(duì)照組和觀察組誘導(dǎo)各時(shí)點(diǎn)的HL-60細(xì)胞，1×PBS洗2次(500 g×5 min)，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度及純度；M-MLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA，UltraSYBR Mixture PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 與對(duì)照組比較，觀察組誘導(dǎo)96 h后的HL-60細(xì)胞體積變小，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)增多，核濃縮，核仁變小或消失，分葉核顯著增多，提示ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系分化。

2.2 兩組細(xì)胞表面CD11b表達(dá)變化 觀察組ATRA誘導(dǎo)96 h時(shí)HL-60細(xì)胞表面CD11b陽(yáng)性表達(dá)率為62.97%±1.90%，高于對(duì)照組的1.87%±0.08%(P<0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞STAT1 mRNA、C/EBPε mRNA、STAT1蛋白、p-STAT1蛋白、miR-155-5p表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，觀察組ATRA誘導(dǎo)后HL-60細(xì)胞中STAT1 mRNA、C/EBPε mRNA、STAT1蛋白、p-STAT1蛋白表達(dá)增加(P均<0.05)，而miR-155-5p表達(dá)降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞STAT1 mRNA、C/EBPε mRNA、STAT1蛋白、p-STAT1蛋白、miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 細(xì)胞中STAT1與miR-155-5p、C/EBPε表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析顯示，細(xì)胞STAT1 mRNA與miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.90，P<0.05)，與C/EBPε mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.96，P<0.05)。

3 討論

STAT1定位于人類1號(hào)染色體，相對(duì)分子質(zhì)量91 kDa，其蛋白由750個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[10]。STAT1主要被干擾素(IFN)激活，參與機(jī)體抗感染，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)及凋亡，并在抑制腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。研究表明，STAT1在細(xì)胞髓系分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其在ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系分化過(guò)程中的作用機(jī)制尚未明確。白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，細(xì)胞分化被阻滯在早期階段，使其不具備成熟細(xì)胞功能。1986年我國(guó)學(xué)者首次以ATRA誘導(dǎo)分化治療APL取得成功，誘導(dǎo)分化療法通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成熟，從而達(dá)到治療目的[1]。然而ATRA誘導(dǎo)療法尚具有療效不穩(wěn)定、部分患者易復(fù)發(fā)等問(wèn)題[2]，因而進(jìn)一步闡釋其誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化機(jī)制將為臨床治療提供新的靶點(diǎn)與途徑。

C/EBPs又稱CCAAT-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，能與DNA增強(qiáng)子CCAAT區(qū)及多種病毒增強(qiáng)子結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活特定基因DNA增強(qiáng)子5′-RTTGCGYAAY-3′重復(fù)序列或其變異體，屬于堿性區(qū)C/EBPs家族[12]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)六類C/EBPs家族成員，包括C/EBPα、β、γ、δ、ε、ζ，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、免疫應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程。其中，C/EBPε是粒細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在髓系細(xì)胞向粒細(xì)胞分化及成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并參與了白血病等腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。C/EBPε特異性表達(dá)于造血細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除C/EBPε基因可使粒細(xì)胞分化阻滯于中晚幼粒細(xì)胞階段，過(guò)表達(dá)C/EBPε基因可以抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)分化[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，C/EBPε基因缺陷小鼠產(chǎn)生形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)和功能不正常的嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，這些小鼠通常只能生存2～5個(gè)月，并最終死于感染[13]。臨床研究顯示，C/EBPε表達(dá)水平和粒細(xì)胞的分化水平相關(guān)，先天性中性粒細(xì)胞缺乏患者C/EBPε基因表達(dá)量極低[12]。因此，促進(jìn)C/EBPε表達(dá)有望成為誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向粒細(xì)胞分化的有效途徑，但目前調(diào)控C/EBPε表達(dá)的靶點(diǎn)與機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示ATRA誘導(dǎo)HL-60向粒細(xì)胞分化過(guò)程中，C/EBPε mRNA與STAT1表達(dá)均顯著升高，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，提示STAT1信號(hào)通路活化C/EBPε可能是ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒細(xì)胞分化的關(guān)鍵機(jī)制之一。

為進(jìn)一步探討ATRA誘導(dǎo)HL-60向粒系分化體系中活化STAT1的分子調(diào)控機(jī)制，我們運(yùn)用TargetScan、DIANA等軟件預(yù)測(cè)靶向調(diào)控STAT1的潛在miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p與STAT1有潛在結(jié)合位點(diǎn)。miR-155-5p作為一種經(jīng)典多功能miRNA，定位于人類染色體21q21，主要表達(dá)于造血細(xì)胞，參與調(diào)控造血、炎癥及免疫反應(yīng)等多種生理與病理過(guò)程。近來(lái)研究[5～9]發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p在多種實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá)升高，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此又被稱為“致癌性微小RNA”[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，在慢性髓系白血病細(xì)胞中EB病毒通過(guò)多種途徑導(dǎo)致miR-155-5p 水平上調(diào)，從而抑制造血細(xì)胞分化。本研究結(jié)果顯示，ATRA誘導(dǎo)HL-60向粒細(xì)胞分化過(guò)程中，觀察組與對(duì)照組細(xì)胞比較miR-155-5p表達(dá)顯著降低，且其表達(dá)與STAT1呈顯著負(fù)相關(guān)。這提示miR-155-5p 可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控STAT1信號(hào)通路參與ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒細(xì)胞分化，但其確切結(jié)合位點(diǎn)及調(diào)控方式尚需進(jìn)一步深入研究。

本研究利用ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系分化，觀察STAT1信號(hào)通路在此誘導(dǎo)分化模型中的作用。結(jié)果顯示，ATRA作用后細(xì)胞形態(tài)有向成熟粒細(xì)胞分化的趨勢(shì)，細(xì)胞表面粒細(xì)胞特征性分子CD11b表達(dá)升高，提示HL-60細(xì)胞在ATRA作用下向粒系分化。同時(shí)，在ATRA誘導(dǎo)后STAT1 mRNA、總蛋白表達(dá)及磷酸化水平均逐漸升高，提示STAT1信號(hào)通路活化在ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。我們發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系分化過(guò)程中，C/EBPε轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，提示促進(jìn)C/EBPε轉(zhuǎn)錄可能是ATRA活化STAT1信號(hào)通路誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向粒系分化的關(guān)鍵機(jī)制之一。在ATRA誘導(dǎo)HL-60向粒系分化過(guò)程中，miR-155-5p表達(dá)下降，提示miR-155-5p可能參與了此過(guò)程中STAT1表達(dá)的調(diào)控。本研究初步證實(shí)了miR-155-5p調(diào)控STAT1信號(hào)通路活化C/EBPε在ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60向粒系分化中的作用及調(diào)控機(jī)制，但具體靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

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