基于基因芯片數據分析非小細胞肺癌H460細胞順鉑耐藥相關的靶基因及信號傳導通路

張夢梅，唐妍，王元艷，柏杰，楊澤，柏玉舉

(1遵義醫學院附屬醫院腫瘤醫院，貴州遵義563000；2遵義醫學院珠海校區)

肺癌為全球病死率最高、發病率第二的惡性腫瘤[1,2]，其中絕大多數肺癌類型為非小細胞肺癌。目前，含鉑兩藥聯合方案化療仍然是非小細胞肺癌的主要治療手段之一，但療效欠佳，且不良反應嚴重[3,4]。鉑類化療藥物耐藥大大降低了化療的療效。然而，鉑類耐藥的機制尚未完全闡明[5]。順鉑是鉑類中最具代表性的化療藥物之一，因此，研究順鉑耐藥的機制，尋找調控耐藥的基因，有助于研發化療增敏劑及在臨床上篩選對鉑類化療敏感的患者，實現精準醫療；也有助于研發新的更為有效的鉑類化療藥物，提高化療療效。近年來，隨著人類基因組測序工程的完成，在大數據的時代背景下，基因芯片廣泛應用于腫瘤學的研究[6,7]。而基因表達數據庫(GEO)則是承載這些基因芯片數據的全球最重要的數據庫之一。2017年7～12月，本課題組通過檢索GEO，提取非小細胞肺癌H460細胞株順鉑耐藥的微陣列芯片數據，使用生物信息學方法對芯片數據進行研究，預測其相關的靶基因及信號傳導通路，獲得新的相關差異基因及信號傳導通路，為后續的臨床和實驗研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數據收集 基因芯片數據來自于GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)。以“Cisplatin-resistant”“non-small cell lung cancer”為檢索詞在數據庫中查詢到ID為5247，芯片數據編號為GSE21656。其中，GSM540420、GSM540421、GSM540422分別為親代H460細胞株樣本(親本組)，GSM540423、GSM540424、GSM540425分別為順鉑耐藥抗拒細胞株樣本(耐藥組)。

1.2 數據預處理 下載芯片數據的全部文件，使用UltraEdit 21.20.0.1001數據編輯軟件打開文件，復制基因名稱信息，樣本編號及數值到Microsoft Office Excel 2013表格(Excel表格單元格格式選擇文本格式)中。使用Excel表格對數據進行排序并刪除數據不全的探針數據。將全部數據從Excel中輸出為“input.txt”格式文本。

1.3 差異表達基因分析 使用R統計語言中的“limma”以及“impute”包，對獲取的芯片數據進行處理，相同基因不同探針數據取均值。原始實驗數據分別使用“normexp”和“quantile”方法進行背景校正和標準化處理。以|差異倍數|≥2且校正后P≤0.05設定檢驗標準，使用R軟件進行貝葉斯顯著性檢驗。|差異倍數|≥2且校正后P≤0.05的探針被認為具有顯著性表達差異。得到差異表達的基因，并輸出為表格，繪制火山圖。

1.4 差異表達基因的功能、所富集的信號通路分析 通過DAVID v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)及Pathway(http://www.pantherdb.org/)在線軟件對差異表達基因進行分析，進一步分析其生物學功能及信號傳導通路。Pathway在線分析軟件分別從生物學過程、細胞組分分析、分子功能分析、信號傳導通路分析四個角度，分析顯著差異表達的基因的功能。并使用基因本體論(GO)對差異表達基因的功能進行分類。同時檢索PubMed，研究所富集的信號通路有無相關文獻報道。

2 結果

2.1 兩組表達顯著差異的基因 H460細胞耐藥組和親本組基因的表達水平存在差異。其中34個基因在耐藥組中差異表達，表達水平顯著上調有7個，顯著下調有27個(表1)。分級聚類分析火山圖初步顯示差異基因的表達，見圖1。

2.2 兩組顯著差異表達基因的功能 34個差異表達的轉錄本在GO注釋中顯著富集(圖2)。表達上調的轉錄本分別在GO:0035025 Rho蛋白信號轉導的正調控(BP)、GO:0030336細胞遷移的負性調節(BP)、GO:0001501骨骼系統的發育(BP)、GO:0007507心臟發育(BP)中顯著富集；而表達下調的轉錄本則在GO:0007155細胞黏附(BP)、GO:0009986細胞膜(CC)、GO:0043679軸突末端(CC)、GO:0016021膜的整體成分(CC)、GO:0007165信號傳導(BP)中顯著富集。這些差異表達的轉錄本多與肌動蛋白細胞骨架、細胞轉移、細胞功能調控以及膜的組成相關。

2.3 兩組差異表達基因所富集的信號通路 采用DAVID在線軟件分析顯示，兩組差異表達上調的基因主要在8條通路中富集，下調基因主要在15條通路中富集，相關文獻報道情況總結于表2。Pathway在線分析軟件顯示，兩組差異表達的基因在16條通路中顯著富集，目前與鉑類耐藥相關的研究情況總結于表3。

3 討論

目前，依據《中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性肺癌診療指南2016.V1》以及最新NCCN指南，化療依然是非小細胞肺癌治療的主要手段之一。標準的一線治療方案為含鉑兩藥聯合，但有效率僅為25%～30%，隨著化療次數增加，耐藥性逐漸顯現。鑒于化療產生的不良反應及易耐藥性，尋找順鉑耐藥基因，預測順鉑的化療效果，指導個體化用藥，針對耐藥基因研發靶向抑制藥物，逆轉鉑類耐藥，在腫瘤的治療中具有重大意義。

表1 兩組表達顯著差異的基因

注：差異倍數2以上的點表示顯著上調的基因；-2以下的點表示顯著下調的基因。

圖1差異基因火山圖

“后基因組時代”的到來，使得基因芯片在現代生命科學研究中具有非常重要的作用[8]。GEO就是一個全球集成的高通量芯片表達譜數據庫，用于儲存、處理、整合全球多組數據，以便檢索、分析及下載，作為信息數據集中和發布的樞紐，是傳統實驗室數據資源的有效補充。既往實驗研究多在提出問題后，從單個基因及通路入手尋找研究的突破點，一方面研究盲目性較高，另一方面易忽視多個基因及多個通路之間的相互作用，而使研究偏離問題的中心。目前，尚沒有相關生物信息學分析非小細胞肺癌順鉑耐藥機制的研究報道。本研究基于GEO數據庫已發表的順鉑耐藥的非小細胞肺癌細胞株芯片，處理數據，并分析其調控基因及信號通路，為尋找順鉑耐藥基因提供了新的有效方法，初步揭示了非小細胞肺癌順鉑耐藥的機制。

圖2 基因共表達網絡

表2 兩組差異表達基因所富集的信號通路(DAVID在線軟件分析)及其文獻報道情況

分析發現，順鉑耐藥H460細胞株中，部分基因表達水平發生了改變。差異分析顯示IGFBP3蛋白在順鉑耐藥機制中起重要作用，這在后續的實驗研究中得到了證實[9]。為了對H460細胞順鉑耐藥差異表達的基因有更加深入的了解，本研究對相關的轉錄本進行GO分析和通路富集分析，結果發現表達具有差異的轉錄本多與肌動蛋白細胞骨架、細胞轉移、細胞功能調控以及膜的組成相關，這說明細胞功能的改變是H460細胞順鉑耐藥發生過程的重要組成部分。DAVID及Pathway在線軟件進行信號傳導通路分析發現，差異表達基因在黏著斑通路、血管內皮生長因子信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶B信號通路、p53基因信號通路等信號轉導通路富集[10～25]，這與GO分析結果相吻合，這也在已報道的非小細胞肺癌順鉑耐藥研究的相關文獻[26,27]中得到了證實。

表3 兩組差異表達基因所富集的信號通路(Pathway在線軟件分析)及其文獻報道情況

本研究還發現,在順鉑耐藥中尚有其他信號通路參與，比如癌癥轉錄失控、血小板活化通路、蛋白質消化吸收、血管生成、CAMs、軸突導向信號等。它們是否在非小細胞肺癌對順鉑耐藥的發生中發揮重要調控作用尚需更進一步的研究證實，這為后續相關研究提供了研究方向。

本研究找出了非小細胞肺癌H460細胞順鉑耐藥相關的差異表達基因，總結并分析了差異表達基因所富集的腫瘤相關通路，為更進一步研究非小細胞肺癌順鉑耐藥的機制提供了重要思路和依據。

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