超聲波法優化沙棘果實多糖及結構的初步研究

蔡 菲，安美忱，劉安妮

（1.中糧營養健康研究院有限公司營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；2.東北農業大學園藝學院，黑龍江哈爾濱 150030）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.），俗稱醋柳、黑刺、酸刺，胡頹子科沙棘屬的灌木或小喬木[1]。其成熟果實為橙黃色的小漿果，近球形，味酸甜，清香且營養豐富[2]。沙棘果實富含多糖、蛋白質、礦物質、維生素、脂肪酸、玉米黃素、蕃茄紅素、黃酮和酚類等營養成分，具有較高的營養價值和保健功效[3]。

多糖，也稱為多聚糖，大多數多糖具有增強機體的細胞和體外免疫功能，誘導細胞因子產生，具有抗感染、抗輻射、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗凝血等活性，既可以作為藥物臨床治療，也可作為功能食品[4]。

研究表明，沙棘果實中的多糖具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、增強免疫力等生物活性[5-6]，同時對于肝炎、心血管系統疾病、動脈粥樣硬化、過敏、促進新陳代謝等[7]也起到了治療作用。

超聲波輔助提取法是天然產物活性成分提取的一種經典方法，目前廣泛應用于天然產物有效成分的提取過程中。超聲波輔助提取法節省試劑，并且提取率高[8]。

試驗采用超聲波法提取沙棘果實多糖，探討最佳提取工藝條件，并用纖維素DEAE和Sepharose CL-6B柱層析進行分離純化，并對沙棘多糖的結構進行初步測定。為今后開發利用沙棘資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘HS-12，黑龍江省農科院漿果研究所提供；木瓜蛋白酶，北京奧博星生物技術責任有限公司提供；纖維素-DEAE，Whatman公司提供；Sepharose CL-6B，Pharmacia公司提供；葡聚糖T-10，T-40，T-70，T-110和T-2000，上海西格瑪奧瑞奇公司提供。

1.2 主要儀器

JY92-2D型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；755PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品；FTS 135型傅立葉變換紅外光譜儀，美國BID-BAD公司產品；高效液相色譜儀，日本島津公司LC-10A產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲波輔助提取沙棘多糖工藝的研究

（1）沙棘多糖的制備。取5.0 g沙棘果果漿，按一定的料液比加入去離子水，在一定的時間和超聲功率下進行超聲波輔助提取多糖。提取液抽濾、濃縮（50℃，真空度＜0.09 MPa），80%乙醇溶液醇沉，靜置過夜（4℃），用微孔濾膜（0.45 μm） 抽濾得沉淀固體，凍干，得到沙棘果粗多糖。利用蒽酮-硫酸法[9]測定提取液中的多糖得率。

（2）超聲波輔助提取沙棘多糖工藝的單因素試驗。以沙棘果果漿為原料（5.0 g），分別研究提取時間、料液比和超聲功率對多糖得率的影響，每次試驗平行3次。

超聲波提取法的單因素試驗見表1。

表1 超聲波提取法的單因素試驗

（3）超聲波法提取沙棘多糖工藝優化試驗。在單因素試驗的基礎上，考查超聲功率、超聲時間和料液比這3個因素的相互影響，進行三因素三水平的正交試驗，采用L9（34）正交表進行正交試驗設計，以沙棘多糖的提取量為指標，確定沙棘多糖的最佳提取工藝。

超聲波提取法的正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 超聲波提取法的正交試驗因素與水平設計

1.3.2 沙棘多糖分離純化的研究

（1） 脫蛋白方法比較。分別稱取1 g沙棘粗多糖，采用Sevag法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶同Sevag法聯用這3種方法來進行脫蛋白處理，比較這3種方法的脫蛋白效果。

（2） DEAE-纖維素分離純化沙棘多糖的研究。將脫蛋白后的沙棘多糖配制成10 mg/mL溶液，利用陰離子交換劑DEAE-纖維素（2.0 cm×30 cm）柱層析進一步分離純化，上樣量為5.00 mL，0～1 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，洗脫劑流速1 mL/min。蒽酮-硫酸法跟蹤檢測至無糖檢出，收集多糖洗脫液，得到2個組分，富集主要多糖組分，再進一步純化。

（3） Sepharose CL-4B凝膠柱層析。將富集主要多糖組分配制成10 mg/mL溶液，利用瓊脂糖凝膠Sepharose CL-4B柱（1.8 cm×40 cm） 分離純化，上樣量為5.00 mL，0.2 mol/L NaCl溶液進行洗脫，洗脫流速為1 mL/min，每1.00 mL為一管，收集洗脫液，蒽酮-硫酸法跟蹤檢測至無糖檢出。根據洗脫曲線收集多糖組分，經濃縮、凍干，得到均一組分沙棘多糖（HRP），采用蒽酮-硫酸法測定純度。

1.3.3 沙棘多糖（HRP） 分子量測定

（1）液相色譜條件。LC-10A型高效液相色譜儀，檢測器，RID-10A型示差折光檢測器，數據處理工作站：Shimadzu CLASS-Vp工作站；色譜柱：Waters Ultrahydrogel 2000，7.8×300 mm；洗脫劑：超純水；進樣量：10 μL；流速：0.7 mL/min；壓力：1.6 MPa。

（2） HRP分子量測定。準確稱取葡聚糖標準品T-10，T-40，T-70，T-110，T-2000 各 2.0 mg，使用去離子水，配制質量濃度為2.0 mg/mL的標準溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取10 μL進樣，分別獲得每種葡聚糖標準品的色譜峰保留時間。通過葡聚糖標準品的分子量對數值與色譜峰保留時間來繪制標準曲線，得到回歸方程。

取2.0 mg沙棘多糖HRL通過以上方法進行操作，可以得到色譜峰的保留時間，采用回歸方程，計算HRL的分子量。

1.3.4 沙棘多糖的紅外光譜分析

通過KBr壓片法，采用FIR-8400s傅立葉變換紅外光譜儀，對HRP的主要官能團進行分析，紅外光譜掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.5 數據處理

所有試驗均重復進行3次，數據均采用平均值±標準偏差（mean±SD） 表示。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

超聲功率對沙棘多糖提取量的影響見圖1，超聲時間對沙棘多糖提取量的影響見圖2，料液比對沙棘多糖提取量的影響見圖3。

圖1 超聲功率對沙棘多糖提取量的影響

圖2 超聲時間對沙棘多糖提取量的影響

圖3 料液比對沙棘多糖提取量的影響

由圖1可知，超聲功率對沙棘多糖的提取量影響顯著。當料液比1∶20，超聲時間45 min，超聲功率在120～480 W時，沙棘多糖的提取量會逐漸增高。當超聲功率為480 W時，多糖提取量最大是12.46±0.61 mg/g。當超聲功率在480～600 W時，多糖的提取量隨功率的增大而下降。可能是因為隨著超聲波功率的增大，植物細胞的破碎作用增強，加速了有效成分的溶解，因此提高了提取量；但當超聲波的功率超過480 W時，溶解的雜質增多，有效成分減少，使得提取量降低。因此，確定最佳超聲功率為480 W。

由圖2可知，當料液比1∶20，超聲功率480 W，超聲時間15～30 min時，沙棘多糖的提取量隨著超聲時間的增加上升緩慢。當提取時間為30～60 min時，超聲時間對沙棘多糖提取量的影響隨著時間的增加而增大。提取時間大于60 min時，增加逐漸緩慢。也許是隨著時間的增加，膜破碎程度漸漸增強，溶出物較多，得率較高。但當繼續破碎時，雜質相應增加，有效成分溶解量減少，得率沒有顯著提高。為節省提取時間，因此選擇超聲時間為45 min，此時沙棘多糖的提取量為6.11±0.24 mg/g。

由圖3可知，當超聲時間為45 min時，功率為480 W時，料液比在1∶10～1∶30，沙棘多糖提取量隨著料液比的升高先增加再減少。料液比在1∶10～1∶20，多糖提取量隨著料液比的增加而升高。當料液比為1∶20時，多糖提取量達到最大，為15.65±0.70 mg/g。這可能是由于溶劑少時體系黏稠不利于多糖的提取，當溶劑達到合適值時，多糖溶出最多，得率最高。當料液比在1∶20～1∶30時，沙棘多糖提取量隨著料液比的增加而降低。因此選取料液比為1∶20作為提取最佳料液比。當料液比為1∶20時，沙棘多糖的提取量達到最大值15.65±0.70 mg/g。然后提取量呈下降趨勢，所以選擇料液比為1∶20。

2.2 正交試驗結果

通過對超聲功率、超聲時間、料液比的單因素試驗，選擇出最佳條件分別為超聲功率480 W，超聲時間30 min，料液比1∶20。在此基礎上進行正交試驗。

超聲波法提取沙棘多糖正交試驗結果見表3。

表3 超聲波法提取沙棘多糖正交試驗結果

由表3可知，3個因素影響總糖提取率的大小分別為A＞C＞B，主要影響參數為A2B3C2。即最佳提取參數為超聲功率480 W，超聲時間55 min，料液比1∶20。因為最佳提取工藝A2B3C2不包括在正交試驗設計表內，考慮驗證結論的準確性，而進行了驗證試驗。其結果為在最佳條件下，總糖提取量達到48.63 mg/g。確定了A2B3C2為最佳工藝，即超聲功率480 W，超聲時間55 min，料液比1∶20。

2.3 沙棘多糖分離純化

2.3.1 不同脫蛋白方法結果比較

脫蛋白方法比較見表4。

表4 脫蛋白方法比較

由表4可知，Sevag法脫蛋白，能夠去除蛋白質51.10%，但是多糖損失率高；單獨使用木瓜蛋白酶法脫蛋白，雖然多糖損失率較低，但是脫蛋白效果差。利用木瓜蛋白酶與Sevag法，在保證多糖含量的同時，最大限度地去除了多糖中的蛋白質，清除率為88.17%±0.43%，此法除蛋白工藝操作簡易、省時，是一種較為理想的除蛋白方法。

2.3.2 DEAE-纖維素和Sepharose CL-4B純化多糖

DEAE-纖維素純化多糖洗脫曲線見圖4，瓊脂糖凝膠CL-4B純化多糖洗脫曲線見圖5。

圖4 DEAE-纖維素純化多糖洗脫曲線

圖5 瓊脂糖凝膠CL-4B純化多糖洗脫曲線

脫蛋白的沙棘多糖采用DEAE-纖維素柱層分離純化多糖的洗脫曲線見圖4，可見得到2個組分。收集主要組分，采用瓊脂糖凝膠Sepharose CL-4B進一步分離純化，得均一組分沙棘多糖（HRL），洗脫曲線見圖5。圖5顯示，洗脫峰是單一的吸收峰，峰形狹窄且對稱，并無拖尾現象，表明沙棘多糖（HRL）純度較高，蒽酮-硫酸法檢測其純度為90.53%±0.47%。

2.4 多糖分子量

利用高效液相色譜可以得到的標準品Dex tranT-10，DextranT-40，DextranT-70，DextranT-110，DextranT-2000保留時間TR及其相對分子量Mw。通過分子量的對數值為縱坐標，以其相應的色譜峰保留時間作為橫坐標，獲得回歸方程lgMw=-0.484 2TR+11.18，相關系數R2=0.997 9。其中，Mw為葡聚糖標準品的相對分子質量，TR為色譜峰保留時間（min）。

試驗計算所得，HRL-3保留時間為12.65 min，通過回歸方程，得到HRL-3的相對分子量Mw為1.32×105U。

2.5 紅外掃描

沙棘精多糖的紅外光譜見圖3。

圖3 沙棘精多糖的紅外光譜

在3 367.85 cm-1處有一個強寬峰為多糖中O-H的伸縮振動峰；在2 931.23處的小肩峰為C-H伸縮振動特征峰；1 743.56 cm-1處為酯化羰基（C=O） 的特征峰，說明多糖HRL-3中存在乙酰基。在1 603.87 cm-1處有特征峰，為羧基（COO-） 的特征峰，表明多糖HRL-3含有糖醛酸。1 417.98 cm-1處為C-H的伸縮振動峰；1 238.51 cm-1處為C-H的變角振動峰。1 016.71 cm-1處為羥基C-O-C鍵伸縮振動峰。913.24 cm-1處為吡喃環的伸縮振動峰；842.83 cm-1處顯示HRL-3含有α-糖苷鍵的特征吸收峰；在718.15處的小肩峰為C-H伸縮振動特征峰。

紅外光譜的分析結果顯示，HRL-3具有多糖的特征吸收峰，同時具有α-糖苷鍵和吡喃糖環。

3 結論

從沙棘（HS-12） 中提取出多糖，確定了超聲波法的適宜提取條件為超聲功率480 W，超聲時間55 min，料液比1∶20，沙棘多糖的提取量為48.63±0.59 mg/g。選取木瓜蛋白酶與Sevag法聯用可有效地去除沙棘多糖的蛋白，清除率達到88.17%±0.43%。通過DEAE-纖維素、SepharoseCL-4B凝膠柱純化后，得到均一組分沙棘多糖，

分子量為1.32×105U，純度90.53%±0.47%。紅光譜掃描顯示沙棘中可能具有多糖的特征吸收峰，并含有吡喃糖環和α-糖苷鍵。

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