脊髓CXCL13在大鼠骨癌痛形成中的作用

吳艷瓊,柯昌斌,許先成,孫艷玲,王賢裕

(湖北省十堰市太和醫(yī)院麻醉科 442000)

骨癌痛是一種復雜難治的慢性疼痛，其確切的發(fā)病機制尚未明了。趨化因子CXC配體13(CXCL13)是CXC趨化因子的一種，主要參與機體的免疫及炎性反應。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13在神經系統(tǒng)中存在表達，并通過激活神經膠質細胞參與慢性疼痛的形成與維持，如神經病理性痛、炎性痛等[1]。骨癌痛中小膠質細胞的激活已被證實[2-4]，其激活參與神經元結構與功能的重塑，介導痛覺過敏的產生和痛覺的持續(xù)狀態(tài)，而CXCL13是否參與骨癌痛的病理、生理過程，有待探討。因此，本研究擬觀察脛骨癌痛大鼠CXCL13表達水平及小膠質細胞活化情況，評價CXCL13在骨癌痛中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年雌性SD大鼠120只，體質量160～200 g，實驗室溫、濕度分別保持為22～24 ℃和40%～60%，采用12 h晝夜周期光照，自由進食、飲水。陰性對照siRNA和CXCL13-siRNA均由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。將120只大鼠分為4組：假手術組(S組)、骨癌痛組(BP組)、小干擾RNA(siRNA)陰性對照(NC-siRNA)組(NC組)和CXCL13-siRNA組(CS組)，每組5例。

1.2方法

1.2.1大鼠脛骨癌痛模型制備 將凍存于液氮中的Walker-256乳腺癌細胞復蘇后，種植于傳代用雌性SD大鼠腹腔，飼養(yǎng)7 d左右出現(xiàn)大量腹水，局部消毒后從腹腔抽取含腫瘤細胞的腹水20 mL；經離心沉淀后，稀釋至所需濃度約每毫升1×108個細胞，保存于冰上備用。腹腔注射氯胺酮50 mg/kg麻醉，BP組、NC組和CS組均采用脛骨髓腔內注射等量Walker-256乳腺癌細胞的方法建立大鼠脛骨癌痛模型，三組大鼠于左脛骨上段切開約5 mm小口，暴露脛骨，5 mL注射器針頭于骨上穿刺打孔，再用微量注射器緩慢注入腫瘤細胞懸浮液5 μL(1×104個)，骨蠟封堵針孔，沖洗并縫合皮膚，創(chuàng)口處涂青霉素鈉粉末預防感染。S組脛骨髓腔內注射等量生理鹽水，其余處理同上。于造模即刻起，NC組鞘內注射NC-siRNA慢病毒10 μL(108TU/mL)；CS組鞘內注射CXCL13-siRNA慢病毒10 μL(108TU/mL)。

1.2.2機械痛閾檢測 參照文獻[5]分別于造模前1 d，術后7、9、14、21 d時采用von FreyTM動態(tài)足底觸覺測量儀(意大利UGO公司)測定大鼠機械縮足閾值(MWT)。大鼠置于金屬籠(10 cm×10 cm×15 cm)，適應環(huán)境20 min，處于靜息狀態(tài)時，開始測定，von Frey絲由下向上垂直刺激右側足底中部皮膚，設定20 s內刺激逐漸由0升高為50 g，當出現(xiàn)快速縮足反應時，刺激自動停止，記錄壓力值，共測3次，間隔5 min，取其平均值作為MWT。

1.2.3HE染色觀察骨結構破壞情況 取假手術和造模后大鼠脛骨。先用4%多聚甲醛固定1周，再在含10%乙二胺四乙酸(EDTA)的固定液中脫鈣4周，石蠟切片。HE染色，鏡下觀察腫瘤生長和骨結構的破壞情況。

1.2.4免疫熒光雙標檢測 痛閾測定結束后，麻醉下迅速暴露心臟，用4%多聚甲醛經左心室灌注，取L4～L6脊髓組織常規(guī)固定,30%蔗糖脫水至沉底，冰凍連續(xù)切片(厚15 μm)，加入封閉液，室溫孵育30 min，PBS漂洗后，同時加入1∶500多克隆山羊抗大鼠CXCL13抗體(美國Abcam公司)和1∶1 000單克隆小鼠抗大鼠NeuN抗體(美國Millipore公司),孵育12 h后，PBS洗滌3次，加入相應熒光標記二抗，室溫孵育2 h后，PBS洗滌3次，用50%甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)觀察CXCL13在神經元上的表達情況和小膠質細胞活化情況。

1.2.5Western blot檢測CXCL13和Iba-1蛋白表達 取L4～L6脊髓，加組織裂解液，經冰浴勻漿后抽提總蛋白，用BCA法進行蛋白濃度定量，取上樣蛋白50 μg(20 μL)，經10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白轉膜2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h；用TBST洗膜3次，加入β-actin(1∶3 000，美國Chemicon公司)和1∶1 000稀釋的羊抗大鼠CXCL13抗體、1∶1 000稀釋的兔抗大鼠Iba-1抗體，洗膜3次，再加二抗(美國Jackson 公司)，室溫孵育2 h，洗膜3次，加入ECL顯色液顯色。應用全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)對顯影膠片進行掃描與分析，以CXCL13和Iba-1條帶積分光密度值與β-actin條帶吸光度值的比值反映CXCL13和Iba-1的蛋白表達。

1.2.6RT-PCR法檢測CXCL13和Iba-1 mRNA表達 從組織標本提取總mRNA，-70 ℃凍存。采用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，遵循PCR引物沒計原則，以GAPDH作為內參照，引物由上海生物工程公司合成，序列見表1。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。計算CXCL13和Iba-1與內參照GAPDH的比值作為目的基因的相對表達量。

表1 RT-PCR 引物序列

2 結 果

2.1各組大鼠術后不同時點機械痛閾的比較 與S組比較，BP和NC組接種后第9天機械痛閾顯著下降，并持續(xù)至實驗結束(P<0.05)；與BP組比較，CS組造模后第9天機械痛閾顯著升高，并持續(xù)至實驗結束(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠術后不同時點機械痛閾的比較

a：P<0.05，與S組比較；b：P<0.05，與N組比較

2.2HE染色結果 光鏡下觀察顯示S組骨髓腔內見各種正常的骨髓細胞，無異常骨結構的改變，模型組術后7 d大鼠注射側脛骨骨髓腔內及骨小梁間被大量腫瘤細胞填充，腫瘤細胞生長活躍，已穿破骨皮質，侵及周圍肌肉及軟組織，后期出現(xiàn)骨質破壞和病理性骨折,見圖1。

A:S組；B：模型組術后7 d；C：模型組術后14 d;D：模型組術后21 d

圖1 S組與模型組骨結構病理學結果(×300)

圖2 脊髓小膠質細胞在各組中的活化情況(×40)

圖3 CXCL13在各組大鼠脊髓中的表達分布(×20)

2.3免疫熒光雙標結果 骨癌痛大鼠脊髓小膠質細胞明顯活化，CXCL13-siRNA慢病毒脊髓注射則明顯減少其活化(圖2)；CXCL13在神經元中存在表達，骨癌痛大鼠脊髓中CXCL13表達升高；CXCL13-siRNA慢病毒脊髓注射則明顯減少CXCL13的表達(圖3)。

2.4CXCL13和Iba-1蛋白及mRNA表達水平 與S組比較，BP和NC組CXCL13和Iba-1蛋白及mRNA水平明顯上調(P<0.05)；與BP組比較，CS組CXCL13和Iba-1蛋白及mRNA表達水平顯著下調(P<0.05),見表4、5。

表4 各組大鼠術后脊髓CXCL13、Iba-1蛋白表達的比較

a：P<0.05，與S組比較;b：P<0.05，與BP組比較

表5 各組大鼠術后脊髓CXCL13、Iba-1 mRNA表達的比較

a：P<0.05，與S組比較；b：P<0.05，與BP組比較

3 討 論

本實驗參照文獻[6]建立大鼠脛骨癌痛模型，該模型操作簡單，評價方法成熟，與人類骨癌痛病理生理學特征相似，已被廣泛應用于骨癌痛的實驗研究。本研究中，模型組大鼠術后各測量時點機械痛閾降低，并出現(xiàn)漸行性加重的自發(fā)痛行為，脛骨HE染色顯示骨質嚴重破壞，假手術組未見明顯異常，行為學及骨破壞研究結果均提示該模型制備成功。

趨化因子CXCL13屬CXC類趨化因子,是定向趨化B細胞的主要調節(jié)因子,與B細胞表面的相應受體發(fā)生特異性結合后可調控B細胞的定向趨化。在慢性疼痛、腫瘤、自身免疫性疾病及多種感染性疾病中,各種T、B、單核細胞都會大量聚集,誘導CXCL13在脊髓及局部組織中大量表達,從而導致疼痛、炎癥的發(fā)生及局部組織器官的損傷[7-8],由此可見CXCL13的異常在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中有著重要作用。本研究結果表明，鞘內注射CXCL13-siRNA慢病毒干擾后，CXCL13在神經元的表達下調，脊髓CXCL13表達亦下調，大鼠對疼痛的耐受程度增強，提示CXCL13參與了骨癌痛的發(fā)生與發(fā)展。

在脊髓水平，膠質細胞不僅對神經元起營養(yǎng)與支持作用，還參與了疼痛的調節(jié)和整合[8]。研究證實，小膠質細胞在慢性神經病理性疼痛的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，抑制小膠質細胞的活化，可減少促炎因子的分泌，抑制興奮性氨基酸、一氧化氮等致痛物質的釋放，從而導致脊髓背角痛覺神經元的興奮性降低[9]。在骨癌痛研究中證實，脊髓小膠質細胞大量激活是引起癌癥患者產生疼痛的重要因素，鞘內給予小膠質細胞抑制劑，可使癌痛大鼠的痛閾顯著增加，明顯減輕其痛行為[10]。本研究中，與S組比較，BP、NC組術后各測量時點Iba-1蛋白表達上調，同時脊髓背角小膠質細胞明顯增生、肥大，而CS組則出現(xiàn)小膠質細胞數(shù)目及突起數(shù)降低，胞體皺縮，提示小膠質細胞的活化參與了大鼠脛骨癌痛的形成。

本研究中，通過檢測小膠質細胞特異性標記物Iba-1的表達，發(fā)現(xiàn)注射CXCL13-siRNA慢病毒后大鼠脊髓小膠質細胞活化程度受到明顯地抑制，CXCL13的表達和小膠質細胞的活化具有同步性，證實了CXCL13的活化是調節(jié)疼痛敏感的重要環(huán)節(jié)。其作用機制可能是癌痛產生后神經元通過自身合成分泌的免疫因子參與小膠質細胞活性的調控，激活小膠質細胞，從而增強突觸后脊髓背角痛覺傳遞神經元的敏感性和反應性，導致中樞敏化[11]，加重骨癌痛。

綜上所述，脊髓CXCL13通過激活小膠質細胞參與了大鼠骨癌痛的形成與維持，抑制CXCL13與小膠質細胞之間的活化通路，能夠有效地阻止或逆轉疼痛的發(fā)生。

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