子宮內膜癌患者病灶超聲造影成像檢查結果、增殖凋亡基因編碼蛋白表達及其相關性分析

回亞男，郝桂純，楊靜，史藝

(1 天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300193；2 天津市第三中心醫院)

子宮內膜癌作為女性生殖系統的三大惡性腫瘤之一，每年有超過28萬的子宮內膜癌患者，占所有惡性腫瘤的7%，發病率和病死率分別占女性生殖系統惡性腫瘤的第一位和第二位，多發于中老年婦女[1,2]。近年來，子宮內膜癌的發病率逐年升高，并且發病人數趨于年輕化[3,4]。目前臨床上主要通過手術治療子宮內膜癌，但是術后仍有超過10%的患者復發，子宮內膜癌復發患者的平均生存期不足1年，因此對子宮內膜癌進行早期診斷具有重要意義[5]。超聲造影成像是近年來新興的無創性檢查手段，被廣泛應用于乳腺癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤的病情評估。超聲造影成像通過時間-強度曲線，計算相應參數，反映子宮內膜癌患者病灶情況[6,7]。雖然子宮內膜癌的發病機制尚未明確，但是細胞增殖和凋亡程序紊亂與子宮內膜癌的發生及發展密切聯系[8，9]。超聲造影成像參數和增殖、凋亡基因表達對于子宮內膜癌的預防和早期診斷具有重要意義，但是兩者的相關性研究并不多見。檢測腫瘤組織增殖、凋亡基因表達需要病理活檢，相對來說超聲造影成像更容易實施。本研究探討子宮內膜癌患者超聲造影參數與病灶組織中增殖、凋亡基因編碼蛋白(Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4和CDK6)表達的關系，旨在進一步明確超聲造影成像的臨床意義，幫助臨床工作者實現降低子宮內膜癌發病率和提高臨床療效的最終目的。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2017年5月收治的子宮內膜癌患者79例，為子宮內膜癌組。納入標準：①患者臨床資料完整，且臨床依從性高；②患者術前均行行超聲造影檢查，未進行放化療；③均行子宮切除術治療；④術中留取腫瘤組織標本經術后病理檢查確診為子宮內膜癌。排除標準：①合并嚴重的臟器病變；②合并消化、血液及內分泌系統疾病；③中途退出研究者；④同時參與多個試驗的患者。入組患者年齡32～67(47.62±3.05)歲；體質量指數19.65～23.02(21.73±1.03)kg/m2；子宮膜厚度3.13～5.52(4.69±0.68)mm；病理分期Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期32例；分化程度低分化30例，中分化25例，高分化24例。留取其術中切取的子宮內膜癌組織標本。另選擇行子宮切除術的53例子宮肌瘤患者為子宮肌瘤組，，患者年齡32～68(47.79±3.12)歲；體質量指數19.53～23.07(21.59±1.02)kg/m2。患者術前均接受過超聲造影檢查，術中均留取子宮肌瘤組織標本。所有留取組織標本凍存于-80 ℃冰箱中待測。兩組患者年齡、體質量指數相比P均>0.05。本研究已獲我院醫學倫理委員會批準，入組患者均已簽署知情同意書。

1.2 兩組病灶超聲造影檢查方法 兩組患者術前均取膀胱截石位進行超聲造影檢查，首先行經陰道常規二維超聲及彩色多普勒超聲確定病灶部位及周邊血流情況，選擇最佳的觀察面，然后肘靜脈注射Sono Vue造影劑2.4 mL，掃描病灶組織。用QLAB軟件計算感興趣區域(病灶)的峰值強度(Peak)、達峰時間(TTP)和造影劑平均渡越時間(MMT)。

1.3 兩組病灶組織Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6蛋白檢測 采用Western blotting法。子宮內膜癌每個樣本中加入4倍濕重的蛋白裂解緩沖液，剪碎、超聲勻漿粉碎后，4 ℃下靜置1 h。以15 000 r/min的速度4 ℃離心10 min，離心半徑為3 cm，提取上清液，即得總蛋白。依次采用SDS-PAGE電泳和轉印，并采用脫脂奶粉進行封閉，滴加一抗后，4 ℃下過夜孵育；二抗在室溫下孵育2 h，然后使用ECL顯色。結果采用Image J軟件半定量分析條帶的光密度值，陰性對照組為β-actin，以Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4和CDK6蛋白條帶與β-actin條帶的光密度值之比表示各蛋白相對表達量。每組重復操作3次，求平均值。

2 結果

2.1 兩組患者病灶Peak、MTT、TTP比較 子宮內膜癌組和子宮肌瘤組病灶Peak、MTT、TTP見表1。子宮內膜癌組病灶Peak、MTT、TTP均高于子宮肌瘤組病灶(P均<0.05)。

表1 兩組患者病灶Peak、MTT、TTP比較

注：子宮肌瘤組相比，#P<0.05。

2.2 兩組病灶組織Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6相對表達量比較 子宮內膜癌組和子宮肌瘤組病灶組織Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6相對表達量見表2。子宮內膜癌組病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6相對表達量高于子宮肌瘤組(P均<0.05)，Bax和Beclin1蛋白相對表達量低于子宮肌瘤組(P均<0.05)。

表2 兩組Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6相對表達量比較

注：與與子宮肌瘤組相比，#P<0.05。

2.3 子宮內膜癌患者癌組織超聲造影參數和增殖、凋亡蛋白表達的相關性 子宮內膜癌患者病灶Peak與病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達量均呈正相關(r分別為0.704、0.692、0.737、0.730，P均<0.05)，與Bax和Beclin1蛋白表達量均呈負相關(r分別為-0.687、-0.709，P均<0.05)；MTT與病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達量均呈正相關(r分別為0.689、0.731、0.725、0.694，P均<0.05)，與Bax和Beclin1蛋白表達量均呈負相關(r分別為-0.714、-0.698，P均<0.05)；TTP與病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達量均呈負相關(r分別為-0.706、-0.725、-0.723、-0.701，P均<0.05)，與Bax和Beclin1蛋白表達量均呈正相關(r分別為-0.696、-0.719，P均<0.05)。

3 討論

由于子宮內膜癌發病過程復雜，一旦確診，大部分患者多處于晚期，早期子宮內膜癌患者5年生存率接近90%，而30%的子宮內膜癌患者多處于晚期，并且伴隨發生遠處轉移和深度侵襲，導致晚期子宮內膜癌患者5年生存率僅16%～66%[10]。近年來，臨床上治療子宮內膜癌的主要方式包括外科手術、放化療及激素聯合治療，這些治療方式均可以在一定程度上緩解病情，但是對合并轉移的患者這些方案的治療效果較差[2]。近年來子宮內膜癌的發病率逐年升高，手術治療后早期患者預后較好，但是晚期患者的預后不佳，Ⅳ期患者5年生存率低，因此在術前進行準確的早期診斷有助于改善預后[11]。腫瘤的發生與發展主要由細胞無限增殖和細胞凋亡不足導致的， 子宮內膜癌患者病灶部位的新生血管很多，給腫瘤細胞的增殖和侵襲提供營養[11,12]。超聲造影是新近發展起來的無創性檢查手段，可以準確有效地反映病灶部位的血流灌注情況，并且可以通過時間-強度曲線的相關參數反映病灶部位血供狀態[13]。本研究結果顯示，子宮內膜癌組病灶Peak、MTT、TTP均高于子宮肌瘤組病灶，說明子宮內膜癌患者病灶部位的血供豐富，血管阻力小，血流量大，呈現快進快出的特點，達峰時間更短，峰值強度更大。

癌細胞增殖狀態是影響子宮內膜癌發展的重要因素，病灶部位新生的血管為腫瘤細胞的增殖提供營養，并且癌細胞增殖過程中受到多種基因的控制，CDK4和CDK6是其中重要的基因[14]。CDK4、CDK6與cyclin D1結合形成復合物促進細胞周期的改變，同時誘導細胞增殖[12]。同時機體通過細胞凋亡消除衰老、受損的細胞，維持機體平衡，凋亡細胞的減少致使增生性疾病的發生。細胞凋亡受到多種凋亡基因的調控[15]，Survivin作為抑制凋亡家族成員之一，定位于17q25，由142個氨基酸組成，分子量為16.5 kD，參與多種細胞凋亡程序，影響多種腫瘤的發生與發展，當Survivin表達水平異常升高時，不僅可以抑制凋亡，而且對于腫瘤細胞的轉化、增殖、轉移及血管新生具有重要作用[16]。Survivin在多種惡性腫瘤中表達水平異常升高，對于子宮內膜癌的診斷具有重要意義[17]。Survivin通過與細胞紡錘體微管上的微管蛋白結合，調節細胞周期，從而抑制細胞凋亡，微管是最強的抑制細胞凋亡因子，能夠通過特殊的結構抑制蛋白效應酶，從而阻滯細胞凋亡[17]。Bcl-2家族蛋白是影響細胞凋亡的蛋白質，定位于18q21，參與細胞增殖和凋亡的平衡調節過程，主要是阻止細胞凋亡，減少腫瘤細胞的丟失量[18]。大量的Bcl-2能夠抑制細胞凋亡，促進其生存，誘發細胞異常積累和惡性轉化，子宮內膜癌組織中Bcl-2的過度表達抑制細胞的程序性死亡，減緩細胞凋亡的速度，提高基因突變的概率，促進子宮內膜癌的發生與發展[17]。Bcl-2廣泛分布于多種生物體內，其凋亡蛋白被凋亡相關因子被激活，轉移到線粒體膜上，破壞線粒體的結構和功能的完整性，使得線粒體內的促凋亡因子，并且逐級放大，最終誘發細胞凋亡[18]。Bax是Bcl-2家族蛋白中的促凋亡基因，基因定位于19q13.3～4，表達蛋白廣泛分布于組織器官中。細胞發生凋亡時，Bax高度表達[19]。受到死亡信號刺激后，Bax從細胞質中轉移到線粒體膜上，與膜結合后形成同源二聚體，加速細胞凋亡，同時轉錄并編碼的蛋白質促進線粒體中的細胞色素C進入細胞質中，激活Caspase家族介導的凋亡級聯放大反應，從而加速細胞凋亡[12]。自噬是Ⅱ型程序性死亡，在多個層面影響腫瘤的發生與發展，如細胞周期和凋亡等，Beclin1是關于自噬的抑癌基因，定位于染色體17q21，是在哺乳動物中發現的第一個自噬相關基因，Beclin1表達水平升高，刺激自噬[20]。Beclin1控制自噬體的成熟，編碼的蛋白質介導自噬過程，降解細胞內的大分子和細胞器，維持細胞穩定，另外Beclin1與Ⅲ型磷脂酰基肌醇 3激酶形成的復合物調節自噬過程[11]。本研究結果顯示，子宮內膜癌組病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達量高于子宮肌瘤組，Bax和Beclin1蛋白表達量低于子宮肌瘤組，說明子宮內膜癌細胞增殖速度加快，凋亡速度變慢，這與王瀚等[12]的研究結果一致。相關性分析結果顯示，子宮內膜癌患者病灶Peak、MTT、TTP與病灶組織CDK4、CDK6、Survivin、Bcl-2、Bax和Beclin1蛋白表達量密切相關，提示血流灌注能夠改變增殖、凋亡基因表達水平，與腫瘤細胞的增殖、凋亡密切相關，可以作為診斷子宮內膜癌的重要手段之一。

綜上所述，子宮內膜癌患者的超聲造影參數能夠反應病變組織和周圍組織的血供情況，豐富的血供不僅上調增殖基因的表達，而且抑制凋亡基因的表達，超聲造影方法值得在臨床上推廣應用。

[1] 王倩,李從鑄,朱彥,等.PELP1和Ki67在子宮內膜癌中的表達及臨床意義[J].婦產與遺傳(電子版),2016,6(4):41-45.

[2] 梁婷婷,于云海,董延磊,等.PDCD5在人子宮內膜癌中的表達及對細胞凋亡的影響[J].實用癌癥雜志,2016,31(11):1749-1753.

[3] Zhou W,Zhang L,Zhan W,et al.Percutaneous laser ablation for treatment of locally recurrent papillary thyroid carcinoma <15 mm[J].Clin Radiol, 2016,71(12):1233-1239.

[4] 李小鵬,張紅麗,何鑫,等.甲狀腺良惡性結節超聲造影特征與病理微血管密度的相關性研究[J].中國臨床醫學影像雜志,2015,26(9):631-634.

[5] 黃小蘭,林元,羅湘閩,等.MACC1、c-Met 在子宮內膜癌的表達和分析[J].暨南大學學報(自然科學與醫學版),2015,36(6):503-508.

[6] Yuan Z,Quan J,Zhang YX,et al.Association between real-time contrast-enhanced ultrasound characteristics and thyroid carcinoma size[J].Mol Clin Oncol， 2015，3(4):743-746.

[7] 趙海云,劉海霞,佟威,等.甲狀腺結節超聲應變彈性成像定量分析對結節良惡性的判斷價值[J].海南醫學院學報,2016,22(11):1179-1181,1184.

[8] 梁艷芳,曾今誠,康東平,等.PTEN、P27和BAG-1在子宮內膜癌中的表達及臨床意義[J].重慶醫學,2014,43(7):785-787.

[9] 周卓,李佳,張千鋒,等.HSF1與 XAF1基因在子宮內膜癌組織中的表達及其相關性分析[J].西安交通大學學報(醫學版),2015,36(2):231-234.

[10] Makker A,Goel MM.Tumor progression, metastasis, and modulators of epithelial-mesenchymal transition in endometrioid endometrial carcinoma: an update[J].Endocr Relat Cancer, 2016,23(2):R85-R111.

[11] 秦燕,王肖力.Livin、Beclin-1在子宮內膜癌中的表達及臨床意義[J].腫瘤學雜志,2015,21(2):128-132.

[12] 王瀚.子宮內膜癌超聲造影參數與病灶組織中癌細胞惡性生物學特征的相關性[J].海南醫學院學報,2017,23(8):1131-1133,1137.

[13] Liu Y,Xu Y,Cheng W,et al.Quantitative contrast-enhanced ultrasonography for the differential diagnosis of endometrial hyperplasia and endometrial neoplasms[J].Oncol Lett, 2016,12(5):3763-3770.

[14] Fan C,Wang W,Jin J,et al.RASSF10 is Epigenetically Inactivated and Suppresses Cell Proliferation and Induces Cell Apoptosis by Activating the p53 Signalling Pathway in Papillary Thyroid Carcinoma Cancer[J].Cell Physiol Biochem, 2017,41(3):1229-1239.

[15] 高秋,李麗萍,牛會林,等.自噬基因Beclin-1與凋亡基因Bax、Bcl-2在子宮腺肌病中的表達及意義[J].中國優生與遺傳雜志,2014,22(2):16-17.

[16] 楊建華,鄭云慧,馬淑梅,等.子宮內膜癌患者經陰道超聲檢測阻力指數與組織中Survivin和癌胚抗原相關細胞黏附分子的關系[J].中國老年學雜志,2015,35(18):5190-5192.

[17] 馮海利,侯亮,梁海峰.子宮內膜癌中Smac、Bcl-2、Survivin和Bax基因的表達及臨床意義[J].中國腫瘤臨床與康復,2016,23(12):1443-1446.

[18] 林瑞芳.人子宮內膜癌組織COX-2和CD44V6及Bcl-2表達臨床意義分析[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(15):1172-1174.

[19] 張建鋒,莊曉萍,羅瑋.Bcl-2和Bax在子宮內膜癌細胞中的表達及臨床意義[J].實用預防醫學,2014,21(6):709-711.

[20] 孟媛,宋敏,許斌,等.Beclin1、Bcl-2在子宮內膜癌中的研究及臨床意義[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2013,7(24):11295-11298.