甲狀腺乳頭狀癌組織中CRNDE的表達(dá)變化及對甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

關(guān)善斌，黃新若，李加偉，黃天斌

(1梧州市紅十字會醫(yī)院，廣西梧州543002；2梧州職業(yè)學(xué)院)

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)約占甲狀腺癌的80%[1,2]。近年來PTC的發(fā)病率呈急劇增長態(tài)勢[3]。對于PTC，采用傳統(tǒng)的治療方案(手術(shù)+131I+甲狀腺素)患者預(yù)后較好，但仍有部分患者療效欠佳[4]。探索PTC的生物學(xué)特性和新的治療途徑仍是臨床醫(yī)生所關(guān)注的問題。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的RNA分子，在生物體生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[5, 6]。結(jié)直腸腫瘤差別表達(dá)基因(CRNDE)屬于lncRNA，已有研究[7～11]表明，CRNDE在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、宮頸癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，與細(xì)胞增殖[10]、凋亡[11]等過程有關(guān)。鑒于CRNDE在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，研究者認(rèn)為CRNDE有望成為一種新型腫瘤特異性標(biāo)志物。目前對CRNDE在PTC中的作用及其相關(guān)機(jī)制尚未有研究報道。因此，本研究觀察了PTC組織中CRNDE的表達(dá)變化，及CRNDE對甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1增殖、遷移、侵襲能力的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 組織標(biāo)本來源：PTC組織標(biāo)本來自2013～2016年在廣西梧州市紅十字會醫(yī)院普通外科行甲狀腺癌根治性切除術(shù)的PTC患者；患者共30例，男23例、女7例，年齡31～65歲，均為首次接受甲狀腺手術(shù)，既往無其他抗腫瘤治療；所取癌組織為距病灶邊緣1 cm以內(nèi)的組織，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實為PTC，癌旁組織為超過腫瘤邊緣2 cm以上的組織。實驗細(xì)胞：TPC-1細(xì)胞來自上海中科院細(xì)胞庫。試劑與儀器：RNAiso試劑、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(日本同仁公司)；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell培養(yǎng)板(美國Conirng公司)；結(jié)晶紫粉末(美國Sigma公司)；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH多克隆抗體(美國Proteintech公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(武漢谷歌公司)；LightCycler 480 Ⅱ System(瑞士Roche公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Western blotting電泳儀及基礎(chǔ)電源系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 PTC組織中CRNDE檢測 按照試劑盒說明書提取PTC組織及其癌旁正常組織的總RNA；取500 ng總RNA為模板按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，以18 s rRNA作為內(nèi)參。CRNDE上游引物序列為5′-GCTATTGTCATGGAGACGGGA-3′，下游引物序列為5′-CCTCGCTTAGACATTGGCCG-3′；18s rRNA上游引物序列為5′-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，下游引物序列為5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3′。以2-ΔΔCt表示CRNDE相對表達(dá)量[12]。

1.3 CRNDE敲低后TPC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力觀察

1.3.1 TPC-1細(xì)胞分組及CRNDE敲低方法 TPC-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于含5% CO2、37 ℃飽和濕度環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。3個CRNDE-siRNA序列由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成。siRNA-1上游引物序列為5′-UCCAAAUGUAUUAUGGAAGCA-3′，下游引物序列為5′-CUUCCAUAAUACAUUUGGAUG-3′；siRNA-2上游引物序列為5′-AAUUUCAGCCAACAUUUGGAG-3′，下游引物序列為5′-CCAAAUGUUGGCUGAAAUUCA-3′；siRNA-3上游引物序列為5′-UAUGAAUUGCAGACUUUGCAG-3′，下游引物序列為5′-GCAAAGUCUGCAAUUCAUAAU-3′。取對數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞消化后按5×104/孔將細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至70%～80%融合度，按照Lipofectamine 3000說明書對TPC-1進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將TPC-1細(xì)胞分為3組：空白對照組不做特殊處理；陰性對照組加入5 μL的Lipofectamine3000和50 pmol的NC-siRNA；敲低組加入5 μL的Lipofectamine3000和50 pmol的CRNDE-siRNA-1/2/3。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，參考"1.2"方法檢測CRNDE。空白對照組、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組CRNDE相對表達(dá)量分別為0.95±0.07、0.86±0.06、0.44±0.06、0.56±0.05、0.16±0.04，3個siRNA轉(zhuǎn)染組CRNDE表達(dá)水平均呈不同程度地下調(diào)，其中以siRNA-3的敲低效果最好，故將siRNA-3序列用于后續(xù)實驗。

1.3.2 TPC-1細(xì)胞增殖能力檢測 于轉(zhuǎn)染24 h后收集三組細(xì)胞，按照1×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)體積為100 μL。分別于細(xì)胞貼壁后0、12、24、48、72 h加入CCK-8試劑10 μL，置于37 ℃環(huán)境中孵育2 h，然后在450 nm波長處測定OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.3 TPC-1細(xì)胞遷移能力檢測 于轉(zhuǎn)染48 h后收集三組細(xì)胞，以不含胎牛血清的RIPM1640培養(yǎng)基重懸，按5×104/孔加入到Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的RIPM1640培養(yǎng)基，孵育24 h后取出上室，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.2%結(jié)晶紫染色25 min，用棉簽插去上室細(xì)胞，水洗上室3次，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野計數(shù)遷移細(xì)胞并拍照保存。

1.3.4 TPC-1細(xì)胞侵襲能力檢測 實驗方法基本同“1.5”，惟一區(qū)別是使用經(jīng)過Matrigel基質(zhì)膠包被的上室，制作方法為：液態(tài)基質(zhì)膠原液以不含胎牛血清的RIPM1640培養(yǎng)基稀釋8倍，取50 μL加入到上室中，置于37 ℃環(huán)境凝固30 min后使用。

1.3.5 TPC-1細(xì)胞中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白檢測 于轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，RIPA法提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白經(jīng)變性后，按20 μg/孔上樣進(jìn)行10% SDS-PAGE蛋白電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉非特異性抗體，分別加入E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶2 000)和GAPDH(1∶2 000)等抗體置于4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，分別加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶5 000)常溫孵育1 h。TBST洗滌3次后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯像并保存圖像結(jié)果，采用Image J軟件分析并計算各組蛋白圖像的相對灰度值。

2 結(jié)果

2.1 PTC組織與癌旁正常組織中CRNDE表達(dá)比較 PTC組織與癌旁正常組織中CRNDE相對表達(dá)量分別為31.99±38.05、4.33±3.30，兩組相比，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較 轉(zhuǎn)染后24、36、48、60、72 h敲低組細(xì)胞增殖能力低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)。24 h開始，敲低組細(xì)胞增殖能力與空白對照比較有統(tǒng)計學(xué)意義。表1。

2.3 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 敲低組、陰性對照組、空白對照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(73±5)、(200±10)、(187±7)個，發(fā)生侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(58±8)、(226±14)、(220±11)個，敲低組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于陰性對照組和空白對照組

(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較 敲低組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白相對表達(dá)量高于陰性對照組和空白對照組，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin蛋白、Vimentin蛋白相對表達(dá)量低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)。詳見表2。

表1 各組TPC-1細(xì)胞OD450比較

表2 各組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌腺惡性腫瘤，其中高達(dá)80%為PTC[1, 2]。PTC的發(fā)生發(fā)展涉及多因素、多階段的改變，尋找PTC治療新靶點及預(yù)后和療效評估標(biāo)志物，有望為PTC的治療提供新的方向[13,14]。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞快速增殖、凋亡抑制、侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)等多方面有關(guān)。研究[15]發(fā)現(xiàn)lncRNA的異常表達(dá)能改變上述生物學(xué)過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。CRNDE為第16對染色體IRX5基因臨近片段的反轉(zhuǎn)錄分子，最早在結(jié)直腸癌中被發(fā)現(xiàn)有高表達(dá)現(xiàn)象，隨后發(fā)現(xiàn)其在肝細(xì)胞癌、胰腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)增高[7～9]。研究[7]表明，CRNDE參與正常細(xì)胞的神經(jīng)分化、胚胎發(fā)育等多種生理活動，而其異常表達(dá)則往往與細(xì)胞惡變密切相關(guān)。為了探究CRNDE在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用，我們首先觀察了PTC組織與癌旁組織中CRNDE的表達(dá)差異，結(jié)果顯示PTC組織中高表達(dá)CRNDE，這是CRNDE可能為促癌基因的重要線索。我們猜測CRNDE可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為從而參與PTC的發(fā)生發(fā)展。

為了進(jìn)一步研究CRNDE在PTC發(fā)病中的作用，我們采用甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1作為研究模型，探索CRNDE對其細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)作用。我們利用siRNA技術(shù)成功敲低TPC-1細(xì)胞中CRNDE的表達(dá)，通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CRNDE的表達(dá)明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。與此同時，下調(diào)CRNDE表達(dá)還可明顯抑制TPC-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。既往研究表明，抑制CRNDE表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞[11]、胰腺癌細(xì)胞[16]的增殖、遷移能力均受到抑制。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)相符，因此，我們推測CRNDE參與調(diào)控TPC-1細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力，并由此影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

EMT是指生物體生長發(fā)育過程中特定細(xì)胞由上皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變。EMT可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，以及在特定部位的定植生長，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。EMT過程包括E-cadherin等緊密黏附連接蛋白表達(dá)減少或重新分布及N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞蛋白表達(dá)上調(diào)，從而使細(xì)胞獲得較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[17]。現(xiàn)已證實分化差的甲狀腺腫瘤中E-cadherin蛋白表達(dá)相對降低，而TGF-β抑制則可調(diào)控EMT進(jìn)程進(jìn)而治療甲狀腺癌。既往研究[18,19]表明，CRNDE可與多種miRNA等分子相互作用，通過Wnt/β-catenin或PI3K/AKT/mTOR/Hippo-YAP等多種通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為，而上述信號調(diào)控通路與EMT發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，敲低組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白相對表達(dá)量高于陰性對照組和空白對照組，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin蛋白、Vimentin蛋白相對表達(dá)量低于陰性對照組和空白對照組，推測CRNDE可能參與腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程，從而增強(qiáng)PTC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，CRNDE在PTC組織中高表達(dá)，并可能通過促進(jìn)PTC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力而發(fā)揮促癌作用；此外，CRNDE可能參與調(diào)節(jié)腫瘤EMT過程，這是其促進(jìn)PTC侵襲與轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一。然后，本研究尚存在一些不足，如組織樣本較少、缺乏臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性分析等，后期可能需要擴(kuò)大樣本并結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)一步驗證結(jié)果；對于CRNDE過表達(dá)后TPC-1細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，我們尚未深入研究，這也是下一步研究的方向。

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