三陰性乳腺癌患者血清HOTAIR、GAS5、MALAT1表達變化及其意義

羅清,曾梓涵，趙玫，黃聲凱，冉立，黃常志

(1遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563000；2肇慶市第一人民醫院；3北京協和醫院；4貴州醫科大學附屬腫瘤醫院)

陰性且人表皮因子受體2(HER-2)無過表達。三陰性乳腺癌易復發、侵襲性高且容易遠處轉移，放化療敏感性均不高，需要尋找新的治療方法[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA一種，文獻報道乳腺癌中一些lncRNA可以通過調節其下游靶基因促進癌細胞增殖、一些IncRNA可以與體內受體某段DNA區域結合影響受體表達最后改變腫瘤細胞對凋亡的敏感性等[2]，但是相關研究都是基于乳腺癌組織或細胞。相對于檢測乳腺癌組織或者細胞中的lncRNA，檢測血清lncRNA更方便。本研究選取的3種IncRNA——HOX 轉錄反義RNA(HOTAIR)、生長停滯特異性RNA5(GAS5)、肺腺癌轉移相關轉錄子1(MALAT1)在乳腺癌組織中的表達與健康乳腺組織相比均存在明顯差異，現研究三陰性乳腺癌患者血清HOTAIR、GAS5、MALAT1水平變化，并分析其與患者臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇35例三陰性乳腺癌患者為觀察組，均為女性，年齡20～65(47±12)歲。其中年齡<45歲9例、≥45歲26例；TNM分期I期20例、Ⅱ～Ⅲ期15例；無淋巴結轉移23例、有淋巴結轉移12例。另選29例無腫瘤病史及家族史、性別和年齡與觀察組匹配的健康體檢者為對照組。本研究已獲醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 血清HOTAIR、GAS5、MALAT1檢測 采集兩組受檢者外周靜脈血5 mL，室溫靜止1 h后，4 ℃下8 200 r/min離心10 min，將上層血清轉移到新收集管，4 ℃下16 000 r/min離心10 min，上清-80 ℃保存。取250 μL血清，加入750 μL TRIzol混勻，室溫裂解5 min。加入200 μL三氯甲烷，上下搖勻EP管15 s,室溫放置10 min后，13 000 r/min離心10 min。取上清液450 μL加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min后，13 000 r/min離心10 min。用75%乙醇洗沉淀，8 000 r/min離心5 min，室溫晾干。加入20 μL RNA-free 水溶解沉淀，-80 ℃保存。將提取的RNA逆轉錄為cDNA。取10 μL cDNA行實時熒光定量PCR。總反應體系為20 μL,其中包括2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ酶10 μL,50×ROX reference dye 0.4 μL,上、下游引物各為0.5 μL(上海生工合成),逆轉錄樣品2 μL,滅菌蒸餾水6.6 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s共40個循環。引物序列： GAS正向引物5′-CTTGCCTGGACCAGCTTATT-3′，反向引物5′-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3′；HOTAIR正向引物5′-ACATTCTGGCCCTGATTTCCG-3′,反向引物5′-CTTACCCCCACGGAGCAG-3′；MALAT1正向引物5′-GAATTGCGTCATTTAAAGCCTAGTT-3′,反向引物5′-GTTTCATCCTACCACTCCCAATTAAT-3′；內參照GAPDH正向引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′,反向引物 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。用2-ΔΔCt表示HOTAIR、GAS5、MALAT1相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件。符合正態分布的數據比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清GAS5、HOTAIR、MALAT1相對表達量比較 兩組血清GAS5、HOTAIR、MALAT1相對表達量見表1。兩組血清HOTAIR相對表達量相比，P>0.05。觀察組血清GAS5相對表達量低于對照組(P<0.05)，MALAT1相對表達量高于對照組(P<0.05)。

表1 兩組血清GAS5、HOTAIR、MALAT1相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2 觀察組血清GAS5相對表達量與患者年齡、TNM分期、淋巴結轉移的關系 年齡<45歲、≥45歲患者血清GAS5相對表達量分別為1.38±1.09、1.34±1.35，P>0.05；TNM分期I期、Ⅱ～Ⅲ期患者血清GAS5相對表達量分別為1.99±1.56、0.53±0.57，P<0.05；無、有淋巴結轉移患者血清GAS5相對表達量分別為1.45±1.34、0.72±0.66，P<0.05。

2.3 觀察組血清MALAT1相對表達量與患者年齡、TNM分期、淋巴結轉移的關系 年齡<45歲、≥45歲患者血清MALAT1相對表達量分別為2.23±2.64、2.61±2.21，P>0.05；TNM分期I期、Ⅱ～Ⅲ期患者血清MALAT1相對表達量分別為2.17±2.27、4.05±2.85，P<0.05；無、有淋巴結轉移患者血清MALAT1相對表達量分別為2.45±2.09、4.97±2.79，P<0.05。

3 討論

lncRNA在多種組織中廣泛表達并且功能多樣，在乳腺癌中的表達與癌細胞凋亡、腫瘤的浸潤轉移以及表觀遺傳學的改變有著密切的關系[3]。許多文獻基于組織中表達的LncRNA，研究其在癌癥組織和正常組織中表達量的差別。本研究篩選出在乳腺癌細胞中高表達的3種lncRNA，比較三陰性乳腺癌和健康人血清這3種lncRNA相對表達量的差異，探討檢測血清中這3種lncRNA相對表達量的臨床意義。

HOTAIR通過結合去甲基化酶復合體阻遏蛋白，使賴氨酸甲基化最終導致基因沉默。其表達在與腫瘤細胞轉移、復發、預后差相關。本研究結果中顯示三陰性乳腺癌患者血清HOTAIR相對表達量與健康人無統計學差異。范方田等[4]報道HOTAIR在乳腺癌轉移灶中高表達。本研究觀察組無Ⅳ期患者，無遠處轉移，筆者認為這可能是三陰性乳腺癌患者血清HOTAIR相對表達量與健康人無統計學差異的原因。

GAS5在細胞中通過抑制細胞分裂、促進細胞凋亡來抑制腫瘤細胞的持續生長[5]。本研究結果顯示，三陰性乳腺癌患者血清GAS5相對表達量低于健康人，這與Mourtada等[6]報道一致。進一步研究發現觀察組患者血清GAS5相對表達量降低與TNM分期和淋巴結轉移有關。Chao等[7]的研究結果中顯示，GAS5的下調程度與腫瘤的分期晚及淋巴結轉移數目多相關。Mark等[8]研究結果顯示，三陰乳腺癌細胞系(MDA-MB-231)中的GAS5表達量高于雌激素受體陽性的乳腺癌細胞系,雙重PI3K/mTOR 抑制劑(BEZ235B)作用后GAS5在三陰乳腺癌細胞中的表達量上升明顯，GAS5和PI3K/mTOR通路可能是三陰乳腺癌治療的新方向。

MALAT1在肺癌中高表達且與其轉移能力呈正相關[9]。MALAT1 在乳腺癌的原發灶與轉移灶中均高表達[10]。本研究結果顯示，三陰性乳腺癌患者血清MALAT1相對表達量高于健康人，且其表達量與患者TNM分期和淋巴結轉移有關，與上述研究結果相符。 Zhao等[11]報道，MALAT1作用于細胞周期G2/M期，通過PI3K/mTOR通路參與細胞增殖和凋亡的調控，這可能是MALAT1參與三陰性乳腺癌發生發展的機制。

綜上所述，三陰性乳腺癌患者血清GAS5表達量低于健康人，血清MALAT1表達量高于健康人，血清HOTAIR表達量與健康人無差異。檢測三陰性乳腺癌患者血清GAS5、MALAT1表達量有助于三陰性乳腺癌的診斷和病情判斷。

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