急性期川崎病患兒外周血Treg/Th17、血清MCP-1、單個(gè)核細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)觀察

徐振宇，趙賀堂，張艷梅，李廣平

(唐山市工人醫(yī)院，河北唐山 063000)

小兒川崎病(KD)是一種兒童急性全身性中、小血管炎，患兒常表現(xiàn)為中小動(dòng)脈免疫性血管炎合并冠脈動(dòng)脈擴(kuò)張、心肌梗死和猝死[1，2]。有研究顯示，KD引起的兒童心血管并發(fā)癥發(fā)生率已經(jīng)超過風(fēng)濕性心臟病，成為兒童獲得性心臟病的主要病因[3]。KD的發(fā)病機(jī)制尚無定論，根據(jù)目前研究報(bào)道推測，KD的發(fā)生、發(fā)展過程與免疫系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)是細(xì)胞免疫的重要組成部分，Treg主要作用為抑制炎癥反應(yīng)，Th17主要功能是促進(jìn)炎癥反應(yīng)，Treg/Th17比例發(fā)生變化表示外周血Treg/Th17平衡被打破，T細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)異常[4]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是重要的趨化因子，在急性炎癥反應(yīng)過程中可以促使單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚集、黏附，是細(xì)胞免疫過程中重要的趨化因子[5]。本研究觀察了急性期KD患兒外周血Treg百分比、Th17百分比、Treg/Th17及血清MCP-1水平、單個(gè)核細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)量的變化，探討細(xì)胞免疫紊亂在急性期KD發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月～2017年5月收治的40例川崎病患兒為急性期KD組。患兒發(fā)病11 d以內(nèi)，有2～3種KD典型癥狀，符合KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜回聲增強(qiáng)，冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑>2.5 mm(小于3歲者)、>3 mm(3～9歲者)、>3.5 mm(9～14歲者)或冠狀動(dòng)脈某一節(jié)段的內(nèi)徑超過相鄰節(jié)段內(nèi)徑的1.5倍。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有感染性發(fā)熱的患兒；②有其他心血管疾病、血液腫瘤疾病的患兒。入組患兒男18例、女22例，年齡2個(gè)月～6歲(2.56±0.67)歲。另選38例恢復(fù)期KD患兒為恢復(fù)期KD組，患兒確診為KD后給予丙種球蛋白治療7 d，除有眼結(jié)膜充血外其余癥狀完全消失。入組患兒男18例、女20例，年齡(2.58±0.71)歲。選取同期行常規(guī)體檢的健康兒童30例為對照組，其中男13例，女17例，年齡(3.02±0.81)歲。三組兒童的性別、年齡相比，P均>0.05。本研究已獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患兒家長均簽署知情同意書。

1.2 外周血Treg、Th17細(xì)胞百分比及Treg/Th17測算 采用流式細(xì)胞術(shù)，按流式細(xì)胞儀說明書操作。

1.3 血清MCP-1檢測 采用ELISA法，按試劑盒說明書操作。

1.4 單個(gè)核細(xì)胞MCP-1 mRNA檢測方法 采用TRIzol一步抽提法對外周血中單個(gè)核細(xì)胞RNA進(jìn)行抽提，然后應(yīng)用UV-1600紫外分光光度計(jì)測定抽提細(xì)胞中的總RNA產(chǎn)量和純度。取5 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。MCP-1上游引物5′-CCTTCTGTCCCTGCTGCTCA-3′,下游引物5′-TCT-TCGGAGTTTGGGTTTGC-3′。PCR反應(yīng)體系含有10×PCR緩沖液5 μ L，氯化鎂(25 mmol/L)5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物(20 μmol/L)1.3 μL，模板DNA 0.1 μg，耐熱TaqDNA聚合酶1.25U，補(bǔ)充去離子水至反應(yīng)總體系為50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min后，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min。以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt表示MCP-1 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血Treg百分比、Th17百分比、Treg/Th17比較 三組外周血Treg百分比、Th17百分比、Treg/Th17見表1。急性期KD組患兒外周血Treg百分比、Th17百分比、Treg/Th17均高于恢復(fù)期和對照組(P均<0.05)；恢復(fù)期患兒外周血Treg百分比、Th17百分比、Treg/Th17均高于對照組(P均<0.05)

表1 三組患兒外周血Treg百分比、Th17百分比、Treg/Th17比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與恢復(fù)期KD組相比，#P<0.05。

2.2 三組患兒血清MCP-1水平和單個(gè)核細(xì)胞MCP-1 mRNA相對表達(dá)量比較 急性期KD組、恢復(fù)期KD組、對照組患兒血清MCP-1水平分別為(420.24±82.4)、(184.75±63.1)、(47.24±53.21)pg/mL，三組患兒血清MCP-1水平相比，P均<0.05。急性期KD組、恢復(fù)期KD組、對照組患兒單個(gè)核細(xì)胞MCP-1 mRNA相對表達(dá)量分別為2.02±0.69、1.28±0.44、0.50±0.27，三組患兒單個(gè)核細(xì)胞MCP-1 mRNA相對表達(dá)量相比，P均<0.05。

3 討論

KD是在兒童人群中呈現(xiàn)高發(fā)性的血管炎性綜合征。研究發(fā)現(xiàn)[7，8]，KD患兒機(jī)體內(nèi)存在內(nèi)皮功能的異常，故有研究認(rèn)為KD的發(fā)病機(jī)制與免疫細(xì)胞、受感染血管壁的細(xì)胞相互作用有關(guān)[9]。MCP-1是趨化因子CC家族中的一員，CC家族的基因大多位于人的第17號(hào)染色體q11～32基因簇上，主要趨化單個(gè)核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，MCP-1在家族中主要功能是趨化和激活單核/巨噬細(xì)胞[10，11]。本研究結(jié)果顯示急性期，KD患兒血清MCP-1水平和外周血單個(gè)核細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)量均高于對照組，恢復(fù)期KD患兒亦高于對照組。KD患兒外周血MCP-1水平升高，急性期KD患兒升高尤為明顯。熊瑞華等[12]發(fā)現(xiàn)KD患兒體內(nèi)MCP-1呈持續(xù)增高狀態(tài)，急性期KD患者血漿MCP-1水平與MCP-1 mRNA表達(dá)水平均明顯高于健康對照組，與本研究結(jié)果相符。筆者推測MCP-1通過趨化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等參與了急性KD的發(fā)病過程。

目前研究認(rèn)為T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂與KD的發(fā)生發(fā)展具有密切相關(guān)性，Treg細(xì)胞屬于T細(xì)胞亞群，主要表達(dá)細(xì)胞表面分子CD4+和CD25+，其主要作用為抑制機(jī)體病理性的免疫反應(yīng)，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性和免疫系統(tǒng)功能[13]。Th17細(xì)胞是新的CD4+T細(xì)胞亞型，主要參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，其主要分泌IL-17、IL-15等細(xì)胞因子，Th17分泌的IL-17和IL-15因子是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中的早期啟動(dòng)因子，其可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌更多的抗炎性細(xì)胞因子，增強(qiáng)IL-1和腫瘤壞死因子的功能[14，15]。本研究中結(jié)果顯示急性期KD患兒外周血Treg 細(xì)胞比例、Th17 細(xì)胞比例、Treg/Th17比值均顯著高于恢復(fù)期KD患兒和對照組,說明KD患兒機(jī)體中存在Treg 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞活化和Treg/Th17失衡。筆者認(rèn)為KD的急性發(fā)病可能與單核細(xì)胞趨化因子分泌異常、Treg細(xì)胞分泌異常有相關(guān)性。KD的發(fā)生過程中可能存在多個(gè)細(xì)胞因子之間相互作用和調(diào)控，這在日后還需要擴(kuò)大樣本量、結(jié)合新的研究方法進(jìn)行深入研究，以篩選KD早期診斷的生物標(biāo)記物。

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