不同劑量珍龍醒腦灌胃對血管性癡呆大鼠學習記憶能力、空間探索能力的影響及其機制

項穎卿，劉燕玲，章國良

(1江西科技學院，南昌 330098；2南昌市第二醫院)

血管性癡呆(VaD)是一種大腦血流減少引起的進行性智力障礙疾病，是常見的老年性癡呆之一，嚴重影響患者認知能力，尤其是執行功能，是繼阿爾茨海默病后的第二大癡呆性疾病[1]。研究[2～5]顯示，某些藥物如乙酰膽堿酯酶抑制劑、N-甲基D-天冬氨酸受體抑制劑、磷酸二酯酶抑制藥等在VaD治療中起到一定的效果，但治療作用有限，且療效不確定[7]。中藥防治VaD的研究日益受到中醫藥研究者的重視，單味中藥或其有效成分防治VaD具有選擇性高、針對性強等特點[8]。珍龍醒腦主要含有珍珠、紫檀香、西紅花、訶子、塞北紫堇、冬葵果等幾十味名貴中藥成分，是治療缺血性腦血管疾病的經典驗方。珍龍醒腦能減少缺血腦組織梗死面積，抑制大腦皮質和海馬神經元凋亡，對腦神經細胞具有保護作用[9]；珍龍醒腦在促進腦梗死患者的語言和肢體功能恢復，減輕腦梗死患者的后遺癥方面療效顯著[10]；但珍龍醒腦治療VaD的研究鮮有報道。目前認為，VaD的發病機制可能與膽堿能環路傳導損傷、突觸可塑性病變、氧化應激、興奮性氨基酸、細胞凋亡等有關[11]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路是一條經典的抗凋亡、促存活的信號轉導通路，廣泛存在各種細胞中。本研究觀察了不同劑量珍龍醒腦灌胃對血管性癡呆(VaD)大鼠學習記憶能力、空間探索能力的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠80只，3～4個月，體質量(250±30)g，雌雄各半，由江西中醫藥大學動物科學部提供。實驗前將大鼠放置在Morris水池中行水迷宮定位航行測試(具體方法見行為學測試)，觀察記錄大鼠的搜索持續時間(逃避潛伏期)，每日訓練1次，連續5 d。計算出大鼠逃避潛伏期的平均成績，以平均成績為參照，剔除不會游泳、體質弱及成績明顯低于平均值的大鼠。通過測評篩選出符合實驗要求的大鼠50只，普通飼料適應性喂養1周，飼養溫度25～26 ℃，每日光照12 h。

1.2 主要藥物與試劑 珍龍醒腦膠囊購自青海金訶藏藥藥業股份有限公司，使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備混懸溶液配置成10 mg/mL的混懸液。PI3K、Akt兔抗鼠多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗動物分組、VaD模型制備及珍龍醒腦給予方法 SD大鼠稱重編號，按照隨機數字表法分為A、B、C、D、E組各10只。前4組采用雙側頸總動脈結扎法制作Vad模型，即大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，頸部用碘伏消毒，正中矢狀切口切開皮膚、皮下組織和筋膜，在雙側頸動脈三角處鈍性分離迷走神經，游離出頸總動脈，取4號絲線結扎阻斷雙側頸總動脈血流，縫合切口；E組除不結扎阻斷頸總動脈外，其余手術步驟均與前4組相同。術后各組均注射青霉素20萬U預防感染。大鼠蘇醒后，A、B、C組分別以50、100、200 mg/kg珍龍醒腦灌胃，D、E組給予等量生理鹽水，1次/d，連續4周。

1.4 大鼠學習記憶能力、空間探索能力評價 給藥4周后，各組隨機取6只大鼠進行Morris水迷宮實驗。水迷宮主要由一個圓形水池和一個可移動位置的平臺組成。水池直徑120 cm，高60 cm，平臺直徑12 cm。將清水注入到水池中至水深30 cm，平臺置于水面以下1 cm處。加入墨汁使池水變為不透明色。Morris水迷宮實驗分為兩部分：①定位航行實驗：按順時針方向依次由第一、二、三、四象限入水點順序，將受試大鼠頭面向池壁放入水中。記錄120 s內尋找平臺的時間(逃避潛伏期)。如果實驗大鼠在120 s內未找到平臺，則將其引上平臺并停留15 s，逃避潛伏期記錄為120 s。以大鼠4次逃避潛伏期的平均值作為其當日的測評成績。連續測試5 d。②空間探索實驗：第6天撤除原平臺，將各組大鼠取同一入水點(第二象限)放入水中，觀察并記錄大鼠60 s內在原平臺所在象限的停留時間百分比(停留時間百分比=停留時間/總游泳時間×100%)，計算跳臺穿越次數(60 s內通過原平臺位置次數和)。

1.5 大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白檢測 給藥4周后，各組另取4只大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，后快速斷頭，取腦組織，石蠟切片，脫蠟至水。依據試劑盒說明書進行操作，采用免疫組化法SP檢測腦組織PI3K、Akt蛋白。400倍鏡下觀察胞質呈棕褐色的細胞為陽性細胞。每張切片隨機選取5個不重疊的視野，數碼相機進行顯微攝影。采用IPP圖像分析軟件進行圖像采集，計數陰性細胞個數。

2 結果

2.1 各組大鼠實驗第1～5天逃避潛伏期比較 結果見表1。

表1 各組大鼠實驗第1～5天逃避潛伏期比較

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05。

2.2 各組大鼠實驗第6天停留時間百分比、跳臺穿越次數比較 結果見表2。

表2 各組大鼠實驗第6天停留時間百分比、跳臺穿越次數比較

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織PI3-K、Akt蛋白陽性細胞數比較 結果見表3。

3 討論

VaD主要表現為記憶力、定向力、計算力等認知功能的改變和情感行為異常，嚴重影響患者日常生活活動能力、生活質量及社會適應能力[8,12]。研究[13]表明，VaD是目前惟一可防治的癡呆性疾病，早期干預有望使病情逆轉。西醫治療VaD的藥物主要有乙酰膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏)、N-甲基D-天冬氨酸受體抑制劑(美金剛)、磷酸二酯酶抑制劑(西洛他唑)、鈣拮抗劑(尼莫地平)等藥物的單用或聯用，但臨床治療效果有限，且療效不確定。中醫認為，VaD多因年老體衰、腎精虧虛、痰濁阻竅、元神失聰所致，治療多從痰、瘀、虛論治，或化痰祛瘀、醒腦開竅，或補腎益精、活血通絡，或益氣養陰，生精填髓等，治療療效多滿意[14]。

表3 各組大鼠腦組織PI3-K、Akt蛋白陽性細胞數比較(個

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05。

珍龍醒腦為傳統藏藥，始載于《四部醫典》，主要由珍珠、西紅花、冬葵果、紫檀香、余甘子、訶子、人工牛黃、木香、塞北紫堇、麝香、短穗兔耳草等中藥組成，具有養陰益氣、開竅醒神，瀉熱通絡、化痰、活血化瘀等功效[15]。多杰等[16]發現，珍龍醒腦在降低血液黏稠度、促使缺血腦組織側支循環暢通、改善腦部供血等方面療效顯著，有益于中風后遺癥患者的恢復。雙側頸總動脈永久結扎(2VO)模型已成為經典的研究VaD及評價藥物的重要動物模型[17]。本研究采用Morris水迷宮實驗評價動物模型的認知功能，結果顯示，與D組比較，A、B、C、E組實驗第2～5天逃避潛伏期短；與A組比較，C組實驗第2～5天逃避潛伏期短。與D組比較，A、B、C、E組實驗第6天停留時間百分比高，B、C、E組跳臺穿越次數多；與A組比較，C組實驗第6天留時間百分比高，B、C、E組跳臺穿越次數多。證實珍龍醒腦對VaD有神經保護作用，且高劑量效果更佳。

PI3K/Akt信號通路廣泛存在各種細胞中，是膜受體信號向細胞內轉導的重要途徑，具有調節細胞增殖、分化、代謝及抗細胞凋亡等作用[18]。正常情況下，細胞內的PI3K含量較少，各種信號轉導刺激物和生長因子均可使PI3K活化，活化后的PI3K使肌醇環上3位的羥基磷酸化，進而3，4-二磷酸磷脂酰肌醇轉化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PIP3作為第二信使再激活其下游蛋白發揮生物效應。Akt又名蛋白激酶B，在靜息狀態細胞中主要存在于細胞質，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PI3K下游的直接靶蛋白。PI3K的激活將致Akt磷酸化，活化的Akt蛋白啟動通路下游的級聯反應，進一步磷酸化和純化其下游底物，通過多種途徑發揮其促進細胞存活、抗細胞凋亡的作用。本課題的前期研究表明，珍龍醒腦膠囊能通過上調Bcl-2、抑制Caspase-3蛋白表達發揮抗神經細胞凋亡作用[9]，但對其上游信號通路未做探討。本研究顯示，與D組比較，B組和C組PI3K、Akt蛋白陽性細胞數增加，E組PI3K、Akt蛋白陽性細胞數減少；與A組比較，B組和C組PI3K、Akt蛋白陽性細胞數增加。表明珍龍醒腦膠囊可以通過增強PI3K/Akt信號通路的活化效應，從而發揮神經保護作用，此結果可為珍龍醒腦在防治VaD方面提供客觀的實驗理論依據。但由于本實驗未涉及到PI3K/Akt信號通路抑制劑及其下游靶基因mTOR相關的神經元自噬作用的研究，具有一定局限性，有待在今后的實驗研究中得到進一步完善。

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