脂肪干細胞與羥基磷灰石/β-磷酸三鈣復合體在兔椎體缺損修復中的應用效果

王騰飛，宋興華，龍志成，麥麥提艾力·阿不力克木，陳江濤，陶穎，楊勇

(新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054)

～11%。脊柱結核是最常見的骨關節結核，占所有骨結核患者的50%以上。骨結核最常用的治療方法是外科手術清除骨結核病灶。而結核病灶清除后，留有的骨缺損稱為結核性骨缺損[2～4]。結核性骨缺損的修復一直是臨床上的難題。自體骨移植是修復結核性骨缺損的“金標準”[5]，但自體骨來源有限，患者術后易出現取骨區感染、疼痛等。同種異體骨移植有免疫排斥、愈合緩慢、容易感染等確點。因此研發新型骨缺損修復材料迫在眉睫。Vacanti等[6]提出的骨組織工程技術為骨缺損的治療提供了新的方法。骨組織工程技術的3個基本要素為種子細胞、支架材料、細胞生長和分化因子。種子細胞是構建骨組織工程和應用的重要環節[7]，脂肪干細胞(ADSCs)作為新的種子細胞，由于來源豐富、取材方便、對機體組織損傷小、增殖快、能多向分化、獲取數量大等眾多優點迅速成為新的研究熱點[8，9]。理想的骨組織工程支架材料需要良好的生物相容性，適宜的生物降解性，羥基磷灰石不僅能滿足以上條件，而且植入體內不僅安全、無毒，還具有一定的骨傳導性[10]。但目前尚未見用rADSCs和羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCA)復合體修復骨缺損的研究。本研究用分化誘導后的rADSCs與HA/β-TCA復合后植入兔椎體缺損中，觀察其修復兔椎體缺損的效果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔38只，雌雄不限，3月齡，體質量(3.0±0.3)kg，均由新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心提供，許可證：SCXK(新2011-0001)。飼養條件：溫度24～27 ℃，相對濕度：55%～60%。動物實驗倫理審批號：IAU90010。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造)、CO2培養箱(力新HF240)、水浴箱(上海精密設備)、UV2550紫外可見分光光度計(日本島津)、1721型電子天平(Sartorius)、酶標儀(Thermo)、流式細胞儀(Beckman)，倒置顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡(Leica)、電鏡(日本日立)、獸醫用X線攝影(天地智慧ELITE 2000 Plus型)。

1.1.3 主要試劑 低糖DMEM 培養基(Gibco公司)、胎牛血清(FBS)、Ⅰ型膠原酶(Worthington)、磷酸鹽緩沖液 PBS(HyClone)、胰蛋白酶-EDTA、青一鏈霉素(Gibco公司)、地塞米松、抗壞血酸、維生素C、β-甘油磷酸鈉、茜紅素染液(Sigma公司)、ALP檢測試劑盒(Sigma公司)、ALP染液(Sigma公司)、人工骨粒復合體(HA/β-TCA，由60%的羥基磷灰石和40%的β-磷酸三鈣組成)。

1.2 rADSCs/HA/β-TCA復合體的構建 取新西蘭大白兔2只，3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉后，無菌條件下取雙側腹股溝區脂肪，分離大體可見的筋膜、血管，用眼科剪剪碎，放入裝含有20 mLPBS的試管離心、消毒、消化，終止消化后加入低糖DMEM完全生長液，間隔2 d換液1次，約85%～90%融合時，進行細胞傳代。 取第3代細胞，加入成骨誘導培養液進行成骨誘導培養，每3 d更換1次培養液，4周后進行茜素紅染色。

取經分化誘導鑒定好的兔脂肪干細胞400 μL(融合率90%)，配制成細胞濃度為3×106/mL的懸液，取12孔板培養皿，每孔放大小約5 mm×5 mm×3 mm大小的HA/β-TCA復合體。吸取1 mL細胞懸液加在各孔內HA/β-TCA支架表面，使得細胞懸液能完全接觸到HA/β-TCA支架的各面。至復合體支架材料各面完全浸泡，然后置于濕化培養箱內孵育，每2 d換液，7 d后用掃描電鏡觀察rADSCs 在支架材料表面和空隙內的黏附及生長情況。電鏡下見材料表面呈多孔狀，rADSC黏附于材料上和空隙中，并向四周延伸，鄰居細胞緊密連接，細胞在復合體上生長良好，增殖明顯方為rADSCs/HA/β-TCA復合體構建成功。

1.3 椎體缺損兔模型的建立、分組及rADSCs/HA/β-TCA復合體植入 其余36只兔用3%戊巴比妥鈉(1～2 mg/Kg)耳緣靜脈注射麻醉，常規備皮消毒鋪巾，沿腰3橫突向下至髂嵴做一長約5 cm縱行切口，逐層分開皮下、肌層，充分顯露L4/5椎體及左側椎旁，在L4/5椎體前緣制備一大小約5 mm×5 mm×3 mm骨缺損。將36只兔隨機分為A、B、C組，各12只。A組植入rADSCs/HA/β-TCA復合體，B組植入單純HA/β-TCA支架材料，C組不植入任何材料。術畢逐層嚴密縫合切口，術區切口涂抹紅霉素，術后連續3 d局部肌肉注射青霉素(80萬U，1次/d)，分籠常規條件飼養。

1.4 修復效果觀察 ①X線：術后4、8、12周行脊柱正側位X線檢查，參照Lane-sandhu X線評分法對骨缺損修復情況進行評分[11]。②大體觀察：術后觀察兔飲食、活動及傷口愈合情況。術后12周處死兔，取缺損區骨組織觀察骨缺損修復、骨痂形成情況。③組織病理學檢查：取出的缺損區骨標本用4%甲醛固定，常規脫鈣，標本流水沖洗過夜，脫水，透明石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，行HE染色，顯微鏡下觀察骨組織結構。

2 結果

2.1 三組兔骨缺損區X線檢查結果 術后4周A組骨缺損區少量骨痂形成，復合體與周圍骨組織緊密接觸。B組缺損區材料與周圍骨組織界線清晰，材料無明顯變化。C組骨缺損區界線清晰，片狀低密度影，未見骨痂形成。術后8周A組骨缺損區較前縮小，骨缺損區可見片狀密度增高影，材料吸收，邊界模糊。B組骨缺損區可見絮狀高密度影，材料與周圍骨組織尚清，少量骨痂形成。C組骨缺損區明顯，可見點狀鈣化影。術后12周:A組骨缺損區復合體材料基本吸收，材料與骨有骨性連接，兩椎體間基本融合。B組骨缺損區大部分修復，部分骨痂形成，邊界模糊。C組骨缺損區邊界尚清，缺損周邊可見片狀鈣化影。術后4、8、12周三組兔骨缺損區Lane-Sandhu X線評分見表1。A、B組兔術后骨缺損區Lane-Sandhu X線評分逐漸上升(P均<0.05)；相同時間點A組兔骨缺損區Lane-Sandhu X線評分高于B、C組(P均<0.05)，B組兔骨缺損區Lane-Sandhu X線評分高于C組(P<0.05)。

表1 術后4、8、12周三組兔骨缺損區Lane-Sandhu X線評分比較(分，

注：與C組相比，*P<0.05；與B組相比，#P<0.05。

2.2 三組兔骨缺損區大體觀察結果 術后所有兔傷口愈合良好，3～4 d后活動、進食基本正常。術后12周處死各組兔取缺損區骨大體觀察，A組可見骨缺損區被骨組織取代，表面未見明顯復合體材料，愈合較好；B組骨缺損區基本修復，邊界不清，有新骨形成，但硬度不高，可見少許纖維組織填充；C組骨缺損區見大量纖維組織，未見成骨形成。

2.3 三組兔骨缺損區組織病理學檢查結果 術后12周后處死各組兔取缺損區骨行組織病理學檢查，A組可見材料吸收明顯，大量纖維骨痂組織生成骨組織，可見少量成纖維細胞及成骨細胞；B組可見部分材料殘留，有纖維性骨痂及少許類骨樣組織形成；C組可見大量纖維結締組織和少許骨痂形成。

3 討論

骨關節結核發病部位廣泛，臨床治愈率不甚理想，且致殘率高，給患者以及患者家屬帶來了極大的社會負擔。盡管隨著外科技術的發展，骨關節結核治療技術有了較大進步，但治療效果仍不理想。結核性骨缺損修復效果決定著骨關節結核手術成功與否。自體骨及同種異體骨移植由于骨組織來源有限，且易出現術區取骨區感染、免疫排斥、愈合緩慢等[12]，在臨床應用非常局限。

骨組織工程的快速發展，為骨關節結核的治療提供了新的思路。利用組織工程學的原理和方法對缺損骨組織進行修復和重建，形成組織工程骨，是一種理想的骨缺損修復材料。它不僅具有自體骨的優點，還可以避免二次創傷等缺點。骨組織工程的3個基本要素為種子細胞、支架材料、細胞生長和分化因子。種子細胞是骨組織工程研究中十分重要的環節，理想的種子細胞應取材方便，來源廣泛，對機體損傷較小，具備定向分化為成骨的能力。骨髓間充質干細胞是早期研究的種子細胞之一，它具有穩定的成骨潛能，且骨髓間充質干細胞易分離培養，經連續傳代后仍可保持較強的增殖能力，但因其獲取創傷較大，實際獲取的骨髓間充質干細胞數量較少，臨床上很難大批量應用[13，14]。脂肪干細胞是存在于脂肪組織中的一種特殊的干細胞，其在一定條件下可以誘導成為骨細胞[15，16]。Tang等[17]將兔自體脂肪干細胞接種于納米羥基磷灰石復合支架上，將其植入兔脊柱，發現復合體與兔脊柱的融合率及新骨生成量明顯高于單純植入支架。本課題組前期實驗所分離、培養的rADSCs通過體外誘導證明了其有多項分化的潛能。本研究將分化誘導后的rADSCs與HA/β-TCA復合材料植入兔椎體缺損區域，結果表明誘導后的rADSCs能夠向骨細胞分化，分化后的成骨細胞可以在支架材料上實現良好的黏附、增殖及遷移。

理想的骨組織工程支架材料不僅需要具備適合細胞生長的環境及細胞親和性，而且需要維持較好的生物力學結構、機械強度、可降解性及生物相容性等。臨床證實，一般在腰椎界面融合需要3～4個月，因此用于腰椎的負重支架材料降解速度不宜過快，單一材料往往不能滿足上述要求。為了彌補單一材料的缺陷，常常將幾種材料進行復合。羥基磷灰石化學成分、晶體結構及物理性能與人體骨骼中磷灰石相似，且鈣磷比與天然骨接近，羥基磷灰石分子中的鈣離子可與含有羥基的蛋白質、有機磷、氨基酸等發生反應，具有良好的生物活性及傳導性。與骨組織結合后促進骨的生長，而且其形態比較穩定，抑制部分腫瘤細胞生長的同時對正常細胞沒有毒性作用，是公認的性能良好的骨修復替代材料[18]。β-磷酸三鈣主要是由鈣、磷組成，其成分與骨基質的無機成分相似，而且β-TCA最終逐漸溶解消失，形成新骨，是理想的人體骨組織修復和替代材料之一。HA/β-TCA構成的復合材料是目前廣泛應用于臨床的人工復合材料，不僅具有較好的生物相容性、可降解性及骨傳導性，可以誘導骨細胞生長，促進骨組織的生成，而且具有良好的孔隙率，有利于種子細胞與材料復合，是骨組織工程中比較理想的支架材料[19～22]。本研究將分化誘導后的rADSCs與HA/β-TCA復合材料體外培養，發現rADSCs較均勻的黏附在復合體上，并填充于支架材料微孔中，細胞在復合體上生長良好，增殖明顯。本研究將分化誘導后的rADSCs與HA/β-TCA復合體植入兔椎體缺損中,結果表明經rADSCs誘導的復合材料更有利于骨缺損的修復。 綜上，rADSCs與HA/β-TCA復合體修復兔椎體缺損效果滿意。本研究的局限性在于觀察時間不長、未研究rADSCs與HA/β-TCA的比例。

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