ZNF268 基因干擾片段轉染對卵巢癌細胞增殖、遷移的影響及其機制

夏震，張琳，蘇琛輝

(暨南大學第二臨床醫學院附屬深圳市人民醫院，廣東深圳518000)

卵巢癌是婦科常見的腫瘤之一，發病率僅次于乳腺癌和子宮頸癌[1]。卵巢癌早期缺乏特異性臨床癥狀，多數患者發現時已經處于晚期[2]；卵巢癌存在多種亞型，不同亞型的組織學來源不同，治療方法也存在著差異，因此卵巢癌的針對治療尤為困難[3]。鋅指268(ZNF268)翻譯的蛋白在結構上分為KRAB結構以及鋅指結構基序兩個部分，。Hamilton等[4]發現KRAB型鋅指蛋白雖然在脊椎動物中大量存在，在進化進程上卻是很晚才出現的，調查發現它在魚類、酵母、細菌等低等生物中不表達，在高等生物如人、鼠、雞體內廣泛存在，提示KRAB型鋅指蛋白參與物種的進化。目前關于ZNF268在卵巢癌發生發展中的作用機制研究較少。cyclin D2、 cyclin E2和CDK2為細胞周期作為從G0/G1向S期運行的正向調節蛋白其表達水平是否得到有效的提高，對研究ZNF268在卵巢癌發生發展中的作用機制有著重要的作用。為此，2017年5～10月，我們觀察了抑制ZNF268基因表達對卵巢癌SKOV-3細胞增殖、遷移、周期的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 卵巢癌細胞系SKOV-3 購自中科院上海細胞庫。攜帶ZNF268 基因干擾片段的重組慢病毒載體(SKOV-3-sh-ZNF268)由廣州賽業生物科技有限公司構建，其中質粒載體為pLLU2G，帶有GFP 標簽，sh-control 為對照載體，sh-ZNF268 為干擾實驗載體，其病毒液滴度均為 4.0×108TU/mL，用無血清無雙抗的DMEM 稀釋10 倍后分裝，每管120 μL，-80 ℃可長期保存。限制性內切酶系統(Takara)購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 聚合酶(KOD Plus TOYOBO)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；T4 DNA 連接酶(Takara)購自寶生物工程(大連)有限公司；RNase A(10 mg/mL)購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；β-actin(C4)(Santa Cruz)購自美國Santa Cruz生物技術公司；anti-SD為本實驗室制備，含有針對ZNF268 蛋白的空間域，能夠檢測ZNF268a 和ZNF268b2 兩種蛋白表達，兔來源；anti-E3為本實驗室制備，針對ZNF268 基因3 號外顯子的編碼產物，能夠檢測ZNF268a 蛋白的抗體，兔來源；細胞周期蛋白及相關蛋白激酶cyclinD1、cyclin D2、cyclinD3、cyclinE1、cyclin E2、CDK2、CDK4、CDK6檢測試劑盒購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的二抗 (HRP-IgG)購自Pierce,公司。超純質粒小量快速提取試劑盒購自美國OMEGA生物技術公司；逆轉錄試劑盒(ReverTra Ace-α,TOYOBO)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；熒光定量試劑盒Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。

1.2 細胞分組及SKOV-3-sh-ZNF268轉染 取對數生長期SKOV-3 細胞，分為觀察組和對照組兩組，分別轉染SKOV-3-sh-ZNF268、SKOV-3-sh-control，后通過實時定量PCR和Western blotting兩種方法檢測兩組細胞SKOV-3-sh-control和SKOV-3-sh-ZNF268中ZNF268在轉錄以及翻譯水平上的表達情況，顯示觀察組中ZNF268 mrNA及蛋白的表達均下調，證明已成功構建下調ZNF268的穩定卵巢癌細胞系SKOV-3-sh-ZNF268和空白對照細胞系SKOV-3-sh-control，用上述兩細胞系進行后續實驗。

1.3 兩組細胞增情況觀察 ①MTT法觀察OD值。取兩組細胞， 消化收集細胞，計數后準備鋪 96 孔板共5 塊，兩組各6 個復孔；用 McCoy's 5A 培養基重懸稀釋細胞使其濃度為8×104/mL，每孔加入100 μL 細胞懸液，放置在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養；每隔一天取出一塊 96孔板，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，pH值7.4)，放回培養箱繼續培養2 h；將培養基與 MTT 吸出，避免液體殘留影響吸光值的測定，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩10 min，使結晶充分溶解；采用自動酶標儀檢測各組細胞在 570 nm波長處的光密度值(OD)。取平均值。②軟瓊脂克隆形成實驗觀察克隆形成率。將事先配好的 0.9%和1.6%的軟瓊脂微波加熱溶解，然后置于42 ℃水浴鍋中保溫；按照 1∶2 的比例混合1.6%的瓊脂糖和McCoy's 5A 培養基(含有2×抗生素和20%的胎牛血清)，取3 mL 混合液注入直徑6 cm 平皿中，冷卻凝固，作底層瓊脂置于37 ℃、5% CO2培養箱中備用。取對數生長期兩組細胞消化離心收集，用含有 20%血清的McCoy's 5A 培養基重懸稀釋至濃度為4 000 /mL 和12 000 /mL 兩個濃度梯度；按照 1∶2 的比例混合0.9%的瓊脂糖和上述細胞懸液，取3 mL 注入鋪有1.6%瓊脂糖底層平皿中，每組濃度鋪3 個平行皿，待上層瓊脂凝固后，用封口膜密封，置入 37 ℃ 5%CO2培養箱中培養；顯微鏡下觀察細胞增殖，當能夠觀察到明顯細胞克隆形成后，每個平皿加入1 mL 的碘硝基四唑紫，放入培養箱染色1 h，拍照計數，觀察兩組細胞克隆數，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數目/接種細胞數×100%。

1.4 兩組細胞遷移情況觀察 采用劃痕實驗。取對數生長期兩組細胞，消化細胞后鋪 6 孔板，每孔細胞數約為106個；細胞培養至鋪滿培養瓶 80%左右準備劃痕，用200 μL的槍頭比著直尺均勻地劃橫縱線，大約每隔1 cm 劃1道；1×PBS 緩沖液清洗細胞3 次，去處劃痕后脫落下的細胞，加入含有2%胎牛血清的McCoy's 5A 培養基；將 6 孔板放回37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養；每過 12 h 觀察，劃痕后24時拍照。測量兩組劃痕寬度并計數細胞遷移數量。

1.5 兩組細胞周期分布檢測 采用碘化丙啶(PI)單染法和流式細胞術。待細胞生長至80%～90%時，消化離心收集細胞SKOV-3-sh-control和SKOV-3-sh-ZNF268各3瓶于1.5 mL離心管中，約2×106個細胞；加入1 mL冰預冷的1×PBS緩沖液清洗細胞兩次，用移液槍輕輕吹打使細胞分散。室溫下1 000 g離心5 min，棄上清；加入500 μL 70%的乙醇，置于4 ℃冰箱固定2 h；加入1 mL冰預冷的1×PBS清洗細胞兩次；室溫下1 000 g離心5 min，棄上清；加入RNase(10 mg/mL)使其終濃度為1 mg/mL，將離心管置于37 ℃，水浴30 min(此步驟勿渦旋振蕩)；加入500 μL的PI綜合染液染色5 min，振蕩混勻，避免細胞成團；用300目的濾網過濾，轉移到流式管中，在流式細胞儀上，采用488 nm的激發波長，在FL3通道檢測。使用 Flowjo 軟件計算各期細胞比例。

1.6 兩組細胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白檢測 收集5×105～10×105個細胞于1.5 mL離心管中，2 000 g離心5 min，棄上層培養基；每管加入1 mL PBS重懸，2 000 g離心5 min，用移液槍吸盡上清，準備制蛋白樣或放入-80 ℃冰箱保藏。配制反應液：按ReagentA∶ReagentB=50∶1的比例配制反應液(按每孔200 μL的用量配制)；待測樣品的準備：在96孔板中用去離子水稀釋5倍蛋白樣(20 μL H2O+5 μL Sample)；每孔加入200 μL反應液，37 ℃低速振蕩反應30 min；于570 nm波長下測吸光值，以β-actin為內參計算各目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞OD570比較 轉染不同時間兩組細胞OD570比較見表1。轉染1、2、3、4、5 d觀察組細胞OD570均高于對照組 (P均<0.05)。

表1不同轉染時間兩組細胞OD570比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2 兩組細胞克隆形成率比較 對照組、觀察組細胞克隆形成率分別為9.7%±2.31%和19.2%±1.5%，兩組細胞克隆形成率相比，P<0.05。

2.3 兩組劃痕寬度和遷移細胞數比較 培養24 h后兩組細胞的劃痕仍然明顯存在，但是觀察組、對照組劃痕寬度分別為(2.53±0.12)、(1.28±0.11)μm，兩組劃痕寬度相比，P<0.05；觀察組、對照組細胞遷移數量分別為(67.59±6.54)、(136.92±10.28)個，兩組細胞遷移數量相比，P<0.05。

2.4 兩組細胞周期比較 觀察組處于細胞周期G0/G1、S和G2/M期的細胞比例分別為62.3%±1.9%、23.0%±1.2%和14.7%±1.8%，對照組處于細胞周期G0/G1、S和G2/M期的細胞比例分別為53.8%±1.8%、19.1%±0.4%和27.1%±2.2%。與對照組比較，觀察組處于G0/G1期和S期的細胞比例增加，而G2/M期的細胞比例減少，P均<0.05。

2.5 兩組細胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對表達量比較 兩組細胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對表達量見表2。觀察組細胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對表達量均高于對照組(P<0.05)。

表2 兩組細胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

卵巢癌是婦科常見的腫瘤之一，在所有婦科癌癥中，其發病率僅次于乳腺癌和子宮頸癌，位居第三位，并且早期的卵巢癌由于缺乏特異性癥狀而難以被檢測出，大多數患者在檢測出卵巢癌時疾病已經發展為晚期，而此時已錯過了癌癥治療的最佳時間。另一方面，由于卵巢癌存在多種亞型，不同亞型的組織學來源不同，相應的治療方法也存在著差異，因此針對卵巢癌的治療顯得尤為困難[5，6]。目前研究發現ZNF268與多種癌癥相關。

Zhao等[11]選取了45例惡性血細胞瘤患者以及17例健康人的外周血，用巢式PCR的方法檢測了不同轉錄本在癌癥患者以及健康人體內的表達情況，結果發現ZNF268a、ZNF268c、ZNF268f和ZNF268g轉錄本有差異表達，提示上述轉錄本可能成為惡性血液細胞瘤的檢測標志。Wang等[12]發現在人類T細胞白血病1型病毒(HTLV-1)感染后的Hut102細胞中，癌蛋白Tax能夠通過調節CREB-1而非CREB-2結合ZNF268上的結合位點來抑制其表達，提示ZNF268可能參與與HTLV-1感染引起的T細胞淋巴白血病。Zeng等[13]在研究ZNF268對造血分化的作用時，利用慢病毒介導的干擾片段下調ZNF268表達，以血細胞系K562為研究模型，結果發現下調ZNF268后K562細胞本地水平的凋亡受到抑制，體外細胞計數以及裸鼠體內成瘤實驗結果證實下調ZNF268能夠促進K562細胞的增殖，以上結果表明ZNF268可能是個潛在的抑癌基因。另外，ZNF268在染色體上的定位為12q24.33，而Engelmark等[14]利用全基因組連鎖掃描的方法發現12q24是宮頸癌發生的敏感位點，并且該位點是許多跟抵抗病毒感染、免疫調節及抑制腫瘤增殖基因所處的區域，提示ZNF268可能與宮頸癌的發生具有一定聯系。

文獻報道，ZNF268在卵巢癌組織及細胞系中高表達，而在正常卵巢組織中沒有表達[15]，故筆者推測下調ZNF268能夠抑制卵巢癌的發生發展，并進行了本研究。通常情況下，癌癥的發展首先是由細胞無節制的增殖引起的，當癌細胞發展到一定的程度，便會向周圍組織器官轉移擴散[16]。盡管增殖與遷移擴散具有某些共同的信號通路，如NF-κB，然而增殖與遷移是兩個不同的生理過程，細胞增殖是通過細胞分裂增加細胞數量的過程，是生物繁殖和癌癥發生所必需的；而細胞遷移是細胞群的移動，并非癌癥發生的必經階段。癌細胞的轉移是惡性腫瘤的重要標志[17，18]，同時也是癌癥患者的主要死亡原因。本研究用劃痕實驗觀察了下調ZNF268對卵巢癌細胞系SKOV-3遷移的影響，結果顯示下調ZNF268表達的觀察組細胞的劃痕寬度大于對照組，遷移細胞數量少于對照組，表明遷移速度慢于對照組，表明下調ZNF268表達能夠抑制SKOV-3細胞的遷移。

細胞無限增殖是癌細胞的重要標志，本研究用體外MTT以及克隆形成實驗觀察下調ZNF268對卵巢癌SKOV-3細胞增殖的影響，結果顯示下調ZNF268能夠促進SKOV-3細胞增殖。提示ZNF268在卵巢癌SKOV-3細胞系中可能發揮一種抑制癌癥發展的作用，ZNF268表達下調后，細胞增殖活性增強，癌癥進一步發展[19，20]。同時，本研究就下調ZNF268對卵巢癌細胞系SKOV-3促進細胞增殖效應的分子機制進行了初步探討，采用PI單染法檢測細胞周期變化，結果顯示下調ZNF268能夠改變SKOV-3細胞周期的分布。隨后用Western blotting法檢測了細胞周期相關蛋白的表達情況，結果發現下調ZNF268以后，cyclin D2、cyclin E2及CDK2的表達水平均提高。以上結果提示，下調ZNF268細胞促進SKOV-3細胞增殖的可能通過上調細胞周期相關蛋白cyclin D2、cyclin E2及CDK2表達，進而調節細胞周期來實現。

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