S100A6基因作用對宮頸癌細胞增殖遷移能力的影響及其機制

姚月榮，劉富群

(1盤錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧盤錦124010；2盤錦市中心醫(yī)院)

S100蛋白家族屬于鈣結(jié)合蛋白超家族，與鈣離子結(jié)合發(fā)生構(gòu)象改變暴露結(jié)合位點后，與靶蛋白結(jié)合并相互作用，在多種生理病理過程中發(fā)揮作用[1～4]。S100A6蛋白屬于S100蛋白家族的A家族，作為細胞內(nèi)蛋白，S100A6參與細胞內(nèi)多種生理病理過程，如增殖、凋亡以及細胞對各種細胞因子的應(yīng)答等。S100A6在不同腫瘤細胞中的表達水平并不一致，在胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤中，S100A6的表達是升高的，而在前列腺癌和口腔癌中S100A6的表達是降低的[5]。譚媛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中S100A6表達上調(diào)，且表達量與宮頸癌惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但關(guān)于S100A6在宮頸癌細胞增殖、遷移過程中發(fā)揮的作用及其機制，目前少有報道。本研究用轉(zhuǎn)染S100A6真核表達載體的方法上調(diào)宮頸癌Hela細胞S100A6表達，用轉(zhuǎn)染S100A6小干擾RNA(siRNA)的方法下調(diào)宮頸癌CaSki細胞S100A6表達，觀察轉(zhuǎn)染后宮頸癌細胞增殖和遷移能力的變化，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的變化，探討上調(diào)或者下調(diào)宮頸癌細胞S100A6表達對宮頸癌細胞增殖和遷移能力產(chǎn)生影響的機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng) 人宮頸癌細胞系Hela、CaSki購自上海科學(xué)院細胞庫，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中(含10% FBS、10×104U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。3～4 d傳代一次，傳代比例為1∶3；取復(fù)蘇后第4～10代的細胞進行相關(guān)實驗。

1.2 細胞分組及S100A6過表達載體、S100A6 siRNA轉(zhuǎn)染 從GeneBank中調(diào)取S100A6基因的編碼區(qū)(CDS)堿基序列(NM_014624.3)，PCR擴增，經(jīng)BamH I和EcoR I酶切后，插入pcDNA3.0真核表達載體，經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定，構(gòu)建pcDNA3.0-S100A6真核表達載體。將Hela細胞接種于6孔板，設(shè)觀察1組、對照1組及空白1組。觀察1組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-S100A6真核表達載體，對照1組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑均為脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(美國Thermo公司)，空白1組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時間為24 h。將CaSki細胞分為觀察2組、對照2組及空白2組。觀察2組轉(zhuǎn)染S100A6 siRNA，序列5′-GUGGCCAUCUUCCACAAGUTT-3′，對照2組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，轉(zhuǎn)染試劑均為脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(美國Thermo公司)，空白2組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時間為24 h。

1.3 各組細胞S100A6 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集各組細胞并用胰酶消化，加入1 mL Trizol(美國Invitrogen公司)抽提細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作。用紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置于-20oC保存?zhèn)溆谩100A6、內(nèi)參GAPDH的實時熒光定量PCR引物序列由南京金斯瑞生物科技公司合成。S100A6正向序列5′-ATGGCATGCCCCTGGATCAGG-3′，反向序列5′-TCAGCCCTTGAGGGCTTCAT-3′；GAPDH正向序列5′-CAGCGACACCCACTCCTC-3′，反向序列5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′。用定量PCR擴增儀(ABI 7500，美國ABI公司)進行擴增并定量檢測S100A6mRNA表達量。實時熒光定量PCR擴增體系為10 μL，反應(yīng)條件：50 ℃ 2min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示S100A6 mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細胞穿膜細胞數(shù)檢測 于24孔板中放置Transwell小室，在24孔板下室中加入500 μL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，Transwell小室中加入100 μL各組細胞懸液(細胞總數(shù)約1×105個)；48 h后去除24孔板下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，室溫放置5 min后顯微鏡下觀察，每孔隨機選取3個視野拍照，記錄每個視野的穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組細胞EMT、PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各組轉(zhuǎn)染24 h的細胞2～5×105個，加入RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)抽提細胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE膠電泳分加入一抗4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，分別加入相應(yīng)的HRP標記的羊抗兔或者兔抗鼠二抗(上海玉博生物科技有限公司，1∶10 000稀釋),室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液(美國Millipore公司)進行化學(xué)發(fā)光顯影，用凝膠成像儀(GelDoc-It，美國UVP公司)對蛋白條帶進行觀察獲取圖像，并對圖像進行灰度分析(Image Lab軟件)。EMT相關(guān)蛋白檢測E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白。PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白檢測p-AKT、t-AKT及下游Snail、Twist蛋白。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組細胞增殖情況觀察 將轉(zhuǎn)染后細胞接種于96孔板中，每孔接種(0.8～1.0)×104個細胞，每組3個孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。棄去上清，加入細胞計數(shù)試劑盒CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定450 nm波長處吸光度值(OD450)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞S100A6 mRNA相對表達量比較 轉(zhuǎn)染24 h觀察1組、對照1組、空白1組Hela細胞S100A6 mRNA相對表達量分別為3.87±0.86、1.04±0.08、0.97±0.11，觀察1組Hela細胞S100A6 mRNA相對表達量與對照1組和空白1組相比，P均<0.05；觀察2組、對照2組、空白2組CaSki細胞S100A6 mRNA相對表達量分別為0.43±0.07、1.12±0.09、0.98±0.12，觀察2組CaSki細胞S100A6 mRNA相對表達量與對照2組和空白2組相比，P均<0.05。

2.2 各組穿膜細胞數(shù)比較 轉(zhuǎn)染24 h行細胞遷移實驗，觀察1組、對照1組、空白1組穿膜細胞數(shù)分別為(48.26±4.89)、(21.31±4.27)、(20.12±6.23)個，觀察1組穿膜細胞數(shù)與對照1組和空白1組相比，P均<0.05；觀察2組、對照2組、空白2組穿膜細胞數(shù)分別為(81.36±8.33)、(147.49±6.98)、(142.23±9.16)個，觀察2組穿膜細胞數(shù)與對照2組和空白2組相比，P均<0.05。

2.3 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達量比較 觀察1組、對照1組、空白1組細胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達量見表1，觀察2組、對照2組、空白2組細胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達量見表2。與對照1組和空白1組相比，觀察1組Hela細胞E-cadherin蛋白表達量較低(P均<0.05)，N-cadherin、p-AKT、Snail、Twist蛋白表達量較高(P均<0.05)，但三組t-AKT蛋白表達量相比P均>0.05；與對照2組和空白2組相比，觀察2組CaSki細胞E-cadherin蛋白表達量較高(P均<0.05)，N-cadherin、p-AKT、Snail、Twist蛋白表達量較低(P均<0.05)，但三組t-AKT蛋白表達量相比P均>0.05。

表1 轉(zhuǎn)染24 h后觀察1組、對照1組、空白1組細胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達量比較

注：與對照1組和空白1組相比，*P<0.05。

表2 轉(zhuǎn)染24 h后觀察2組、對照2組、空白2組細胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達量比較

注：與對照2組和空白2組相比，*P<0.05。

2.4 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后OD450比較 轉(zhuǎn)染24 h后繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，觀察1組、對照1組、空白1組Hela細胞OD450相比P均>0.05；繼續(xù)培養(yǎng)72 h,觀察1組Hela細胞OD450高于空載體組和空白對照組(P均<0.05)。詳見表3。轉(zhuǎn)染24 h后繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，觀察2組、對照2組、空白2組CaSki細胞OD450相比，P均>0.05。繼續(xù)培養(yǎng)72 h,觀察2組CaSki細胞OD450低于對照2組和空白2組(P均<0.05)。詳見表4。

表3 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h觀察1組、對照1組、空白1組OD450比較

注：與對照1組、空白1組相比，*P<0.05。

表4 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h觀察2組、對照2組、空白2組OD450比較

注：與對照2組、空白2組相比，*P<0.05。

3 討論

S100A6基因定位于染色體1q21，是腫瘤細胞中頻繁出現(xiàn)染色質(zhì)重組的位點。S100A6基因最早發(fā)現(xiàn)于嚙齒類動物的成纖維細胞中，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，如參與細胞增殖凋亡調(diào)控、調(diào)節(jié)酶活性、調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化和維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等[7]。

在心肌疾病[8]和多種腫瘤細胞中，S100A6表達是升高的，但是導(dǎo)致S100A6升高的原因并沒有被完全闡明。多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)S100A6基因啟動子活性[9, 10]。在胰腺癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌和肝癌中，S100A6常常被用作診斷和預(yù)后的生物學(xué)分子。在甲狀腺癌中，S100A6表達增加并且在乳突型甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[11]。宮頸癌細胞中S100A6在Hela細胞中低表達，而在CaSki細胞中高表達。故本研究選用Hela細胞觀察過表達S100A6對宮頸癌細胞的影響，選用CaSki細胞細胞觀察沉默S100A6對宮頸癌細胞的影響。結(jié)果顯示，在Hela細胞中過量S100A6蛋白后，能夠增強Hela細胞的增殖和遷移能力；采用siRNA片段干擾CaSki細胞中S100A6基因表達，可以使細胞的增殖能力和遷移能力均下降。表明S100A6蛋白參與了宮頸癌細胞增殖和遷移的調(diào)控。

近年來的研究證實，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，涉及多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和分子機制，包括鈣連接素、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、生長因子、微環(huán)境等。腫瘤細胞發(fā)生EMT的典型特點是上皮細胞表型缺失，其上皮標志蛋白E-cadherin的表達降低，失去極性，并且表現(xiàn)出間質(zhì)細胞的特性，同時間質(zhì)標志蛋白N-cadherin表達增加。本研究中結(jié)果顯示，使用S100A6真核表達質(zhì)粒使Hela細胞中S100A6蛋白表達增加后，細胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達下降、N-cadherin表達增加。通過轉(zhuǎn)染S100A6 siRNA降低CaSki細胞中S100A6基因表達后，細胞中E-cadherin表達增加、N-cadherin表達下降，以上實驗結(jié)果表明，在宮頸癌細胞中S100A6基因表達能夠促進細胞EMT，進而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

有關(guān)S100A6參與腫瘤細胞增殖、遷移調(diào)控機制的相關(guān)研究較多。在胃癌細胞中，S100A6能夠通過干擾β-catenin的蛋白降解過程，負調(diào)控CacyBP/SIP介導(dǎo)的抑制細胞增殖和腫瘤形成作用，進而促進胃癌發(fā)生發(fā)展[13]，此外，S100A6能夠促進胰腺導(dǎo)管腺癌細胞遷移和侵襲，并且通過激活β-catenin促進EMT[14]。在腎臟細胞癌中，S100A6表達增加后能夠抑制抗腫瘤趨化因子CXCL14的表達以及CXCL14誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而促進細胞存活[15]。陸文銓等[16]采用基因沉默技術(shù)干擾食管癌細胞Eca109中S100A6基因表達后，細胞的增殖活性和遷移能力均明顯被抑制。在人骨肉瘤細胞143B中，有學(xué)者用重組人S100A6蛋白(rhS100A6)與PI3K抑制劑(LY294002和wortmannin)單獨或者同時培養(yǎng)細胞后，發(fā)現(xiàn)rhS100A6能顯著增強143B細胞的增殖和遷移能力，而PI3K抑制劑則能夠部分逆轉(zhuǎn)此效果，證實S100A6促進人骨肉瘤細胞143B增殖和遷移的作用，至少部分是通過激活PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，在Hela細胞中增加S100A6蛋白表達后，細胞中的p-Akt蛋白表達量也顯著增加。Akt磷酸化是激活PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵步驟。這說明S100A6能夠激活宮頸癌細胞中的PI3K/Akt信號通路。本研究還發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路的下游靶基因Snail和Twist的蛋白表達水平也有不同程度的升高；下調(diào)CaSki細胞中S100A6表達后，各蛋白表達量變化向相反方向進行。這進一步證實了PI3K/Akt信號通路在S100A6過量表達后被激活。。

綜上所述，S100A6能夠促進宮頸癌細胞的增殖和遷移過程，這可能是可能是通過激活細胞PI3K/Akt信號通路進而促進細胞EMT實現(xiàn)的。這為進一步闡明S100A6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機制提供了實驗依據(jù)。S100A6有可能是宮頸癌診斷和治療的潛在靶標。

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