食管鱗癌組織中ABCG2、p16表達變化及意義

陳曉依，呂洋，劉博，李秀娟，劉軍超，常楚迪

(1河北北方學院，河北張家口075000；2河北北方學院附屬第一醫院)

食管癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤。研究顯示，我國食管癌發病率占全部惡性腫瘤的第5位，病死率占第4位，其最常見的組織學類型為鱗狀細胞癌(ESCC)[1]。目前外科手術仍為其治療的首選方法，但早期食管癌患者術后5年總生存率僅30%；手術治療效果差的原因主要為局部復發、遠處轉移，而且術后患者機體免疫力低下[2]。ABC跨膜轉運體家族是人類最大的轉運蛋白基因家族，其中三磷酸腺苷結合盒轉運體蛋白2(ABCG2)是ABC家族轉運蛋白G族第2個成員，在多種腫瘤組織中呈高表達[3]。p16基因是近年來發現的繼p53基因之后的又一抑癌基因，又稱為多腫瘤抑制基因,屬于cyclin-CDK復合物的特異性抑制劑，且為細胞周期調控的分子開關[4]。本研究主要觀察ABCG2、p16在ESCC組織中的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2009年12月河北北方學院附屬第一醫院行手術治療的原發性ESCC患者136例，均經病理檢查確診，男91例、女45例，年齡27～80歲、中位年齡61歲，術前均未接受過治療。術中留取ESCC組織。另取性別、年齡相匹配ESCC患者的正常食管黏膜組織(距癌組織>5 cm)37例份作對照。本研究患者均知情同意，且經醫院倫理委員會批準。

1.2 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、P16蛋白表達檢測 采用免疫組化SP染色法，嚴格按試劑盒說明書操作。取石蠟切片，經檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓抗原熱修復，陰性對照用PBS代替。結果判定：ABCG2蛋白主要定位于細胞膜，p16蛋白主要定位于細胞核，以呈現棕黃色顆粒為細胞染色陽性。高倍鏡下，每樣本隨機選取5個視野，計算陽性細胞百分比。陽性細胞百分比<25%計1分，25%～50%計2分，≥50%計3分；著色強度為無色計0分，灰黃色計1分，金黃色計2分，棕黃色計3分。將以上兩項評分相加，<3分為表達陰性，≥3分為表達陽性[5]。以上均至少由兩名病理醫師在雙盲條件下觀察。

1.3 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、p16 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。將組織置于液氮中充分研磨，用TRIzol法提取組織細胞總RNA，參照TaKaRa試劑盒說明書進行反轉錄和目的基因ABCG2和p16(大連寶生物公司)的擴增，以GAPDH(大連寶生物公司)為內參。ABCG2引物(280 bp)：上游5′-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3′、下游5′-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3′；p16引物(522 bp)：上游5′-TGGCTCTGACCATTCTGT-3′、下游5′-AGCTTTGGAAGCTCTCAG-3′；GAPDH引物(452 bp)：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。擴增反應體系試劑盒(大連寶生物公司)20.0 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，sense primer(10 pmol/μL)0.8 μL，antisense primer(10 pmol/μL)0.8 μL，dH2O 7.0 μL，cDNA模板1 μL。擴增條件：預變性95 ℃、30 s，1個循環。PCR反應：95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，40個循環。用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、p16蛋白陽性表達率比較 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2蛋白陽性表達率分別為62.5%(85/136)、24.3%(9/37)，p16蛋白陽性表達率分別為32.4%(44/136)、56.8%(21/37)。與正常食管黏膜組織比較，ESCC組織中ABCG2蛋白陽性表達率高(P<0.05)、p16蛋白陽性表達率低(P<0.05)。

2.2 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2、p16 mRNA表達比較 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ABCG2 mRNA相對表達量分別為0.76±0.06、0.58±0.04，p16 mRNA相對表達量分別為0.39±0.03、0.62±0.05。與正常食管黏膜組織比較，ESCC組織中ABCG2 mRNA相對表達量高(P<0.05)、p16 mRNA相對表達量低(P<0.05)。

2.3 ABCG2及p16蛋白陽性表達與患者臨床病理參數的關系 ABCG2及p16蛋白陽性表達與腫瘤浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡及腫瘤組織學分級無關(P均>0.05)。見表1。

2.4 ESCC組織中ABCG2與p16蛋白表達的相關性 ABCG2與p16蛋白在ESCC組織中的表達呈負相關(r=-0.438，P<0.05)。

表1 ABCG2及p16蛋白陽性表達與患者臨床病理參數的關系(例)

3 討論

近年來，隨著化療藥物及方案的改進，食管癌的化學治療取得了很大的進步，但耐藥仍是腫瘤化療的主要難題之一，其對化療效果和患者預后有較大影響。多重耐藥的形成與多藥耐藥基因、蛋白的高表達有密切聯系[6]。ABCG2又稱乳腺癌耐藥蛋白，是近年來發現的ABC超家族成員之一，定位在人體染色體4q22中，具有1個ATP結合位點和1個跨膜區[7]。其主要通過參與泵出細胞內的化療藥物，降低胞內藥物含量，引起耐藥[8]。本研究檢測發現，ABCG2在ESCC組織中的陽性表達率高于正常食管黏膜組織。進一步研究發現，ABCG2蛋白陽性表達與ESCC患者性別、年齡及組織學分級無關，與腫瘤的浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移有關，腫瘤侵至全層、TNM分期高、有淋巴結轉移的患者ABCG2的陽性率高。同時發現，ESCC組織中ABCG2 mRNA的相對表達量高于正常食管黏膜組織，進一步提示ABCG2高表達可能與ESCC的發生發展相關。

p16是近年來發現的抑癌基因，由148個氨基酸構成，位于9號染色體短臂21～22區(9p21～22)，編碼產物為含有4個獨特的錨蛋白重復結構。p16在腫瘤發展過程中發生突變、缺失及甲基化導致失活，最終引起腫瘤的發生[9]。Mathew等[10]研究顯示，p16的缺失與ESCC病理分期及遠處器官轉移相關。本研究發現，p16蛋白在ESCC組織中的陽性表達率低于食管正常黏膜組織。這說明與惡性黑色素瘤、尿路上皮癌、神經膠質瘤、前列腺腺癌和透明細胞性腎細胞癌等惡性腫瘤類似，p16在ESCC組織中的表達低于其在正常黏膜組織中的表達[11]。另外，腫瘤侵至全層、TNM分期高、有淋巴結轉移的患者p16的陽性率低，這與趙醒等[12]的研究結果一致。同時發現，ESCC組織中p16 mRNA的相對表達量低于正常食管黏膜組織，以上結果均說明p16基因的低表達可能與ESCC的惡性程度有關。相關分析顯示，ABCG2與p16在ESCC組織中的表達呈負相關，說明二者在ESCC的發生發展過程中可能協同作用，共同影響腫瘤的進展。

綜上所述，ABCG2和p16在ESCC組織中的異常表達可能與腫瘤的發生發展相關，研究兩者的表達情況有助于ESCC的輔助診斷及指導治療。

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