長鏈非編碼RNA HOTAIR在急性髓系白血病患者外周血中的表達變化及意義

鄭轉珍，貢榮，李國霞，任方剛，徐麗娟

(1山西醫科大學第二臨床醫學院，太原030001；2山西大醫院)

急性髓系白血病(AML)是一類高度異質性的造血系統惡性腫瘤，以骨髓和外周血中未成熟骨髓干細胞的快速積聚和惡性增殖為特征[1]。近年來，在AML的風險評估、緩解后化療和造血干細胞移植等方面，取得了巨大進步[2]。盡管大多數接受化療的AML患者能夠獲得完全緩解，其中僅約20%的完全緩解患者能夠獲得長期無復發生存[3]。因此，為提高AML的診斷、治療效率，仍需對AML的發生發展機制進行深入探討。研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在造血干細胞分化和AML等血液惡性腫瘤中均發揮作用[4]。HOX基因的反義基因間RNA(HOTAIR)，由HOXC基因的反義鏈轉錄生成，長度約2.2 kb。研究證實，lncRNA HOTAIR在多種腫瘤的惡性進展過程中發揮調節作用[5]。而關于lncRNA HOTAIR在AML患者外周血中的表達變化，以及lncRNA HOTAIR在AML診斷、治療中的應用價值，尚未有報道。本研究采用qRT-PCR法檢測lncRNA HOTAIR在AML中的表達變化，并分析lncRNA HOTAIR表達與AML患者臨床病理參數、預后的關系，探討lncRNA HOTAIR在AML發生發展過程中的作用，以期作為AML診斷、治療的新靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年6月～2015年1月于山西醫科大學第二醫院初診AML的患者96例，均符合法美英合作組AML的診斷標準[6]。其中男52例、女44例，年齡19～70(46.21±12.87)歲；WHO分型[7]M1型5例、M2型30例、M4型13例、M5型34例、M6型14例。其中接受DA方案(柔紅霉素、阿糖胞苷)誘導化療86例，化療2個周期完全緩解56例。根據患者的身體狀況，完全緩解的患者，在鞏固強化階段均接受高劑量或中等劑量的以阿糖胞苷為基礎的化療。其余10例未接受治療，且均未獲得完全緩解。同期選擇性別與年齡相符的健康志愿者30例。入選者均簽署知情同意書；本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 樣本收集 采集AML患者與健康志愿者的晨起空腹靜脈血3～5 mL，置于EDTA抗凝管，4 ℃靜置1 h，采用Ficoll密度梯度離心法(人外周血單核細胞分離液試劑盒，北京索萊寶科技有限公司)，4 ℃、400 g 離心30 min，收集外周血中的單核細胞，洗滌后沉淀。采用磁珠分離法(免疫磁珠分選試劑盒，德國美天旎生物技術有限公司)分離外周血中的CD34陽性單核細胞。

1.3 外周血中lncRNA HOTAIR 表達檢測 采用qRT-PCR技術。用TRIzol法提取單核細胞的總RNA，按照RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)的說明書進行操作。用紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度，逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進行逆轉錄，cDNA產物置于-20 ℃保存備用。qRT-PCR引物序列(南京金斯瑞生物科技公司)如下：lncRNA HOTAIR正向引物：5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAG-3′，反向引物：5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGC-3′；18S rRNA正向引物：5′-AGGACATGCATGGACACAGA-3′，反向引物：5′-GGACGGAATCAACTCTGACA-3′。用定量PCR擴增儀(ABI 7500，美國ABI公司)檢測lncRNA HOTAIR表達。qRT-PCR擴增體系10 μL；反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，35個循環。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA HOTAIR的相對表達量。以大于等于相對表達量平均值為lncRNA HOTAIR高表達，小于其相對表達量平均值為低表達。

1.4 隨訪 對完全緩解56例患者采用電話或門診就診的方式進行隨訪。隨訪時間為進入完全緩解期后1～60個月至患者復發、死亡或2017年6月。

2 結果

2.1 AML患者外周血中LncRNA HOTAIR表達變化 初診AML患者、完全緩解患者化療前后、健康志愿者外周血中LncRNA HOTAIR相對表達量分別為3.92±0.47、4.82±0.36、2.91±0.13、1.15±0.18。初診AML患者外周血lncRNA HOTAIR相對表達量高于健康志愿者(P<0.05)；完全緩解患者化療后外周血lncRNA HOTAIR相對表達量低于化療前(P<0.05)。

2.2 LncRNA HOTAIR表達與AML患者臨床病理參數的關系 LncRNA HOTAIR高表達與AML患者的年齡、性別、FAB亞型、是否完全緩解及AML危險度分層無關(P均>0.05)，與白細胞計數(WBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)水平有關(P均<0.05)。見表1。

2.3 LncRNA HOTAIR表達與AML患者預后的關系 行誘導化療的AML患者86例，其中lncRNA HOTAIR高表達54例、低表達32例。 lncRNA HOTAIR高表達患者化療完全緩解率為50.00%(27/54)，低表達患者化療完全緩解率為90.62%(29/32)，比較差異有統計學意義(P=0.000)。lncRNA HOTAIR高表達完全緩解患者的總生存時間為(15.30±1.94)個月，lncRNA HOTAIR低表達完全緩解患者總生存時間為(30.52±2.34)個月，比較差異有統計學意義(P=0.000)。

表1 LncRNA HOTAIR高表達與AML患者臨床病理參數的關系(例)

3 討論

AML是成人最常見的急性白血病類型，起病急，病程進展迅速，發病率和病死率均呈逐年增高趨勢[8]。為提高AML患者的治療效率、改善AML患者的預后，近年來，越來越多的研究傾向于揭示AML的發病機制，尋找新的治療靶標[9]。

LncRNA的異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關，且多種lncRNA被證實與血液系統惡性腫瘤相關[10]。LncRNA HOTAIR是首個被發現的LncRNA，在胃癌[11]、宮頸癌[12]等多種惡性腫瘤組織中異常高表達，發揮促癌基因的功能。lncRNA HOTAIR可與多梳蛋白抑制復合物2(PRC2)相互作用，促進PRC2到達靶基因染色質區，調節下游靶基因表達，促進肝癌細胞侵襲轉移。此外，lncRNA HOTAIR參與獲得性耐藥的產生。如在肺癌A549/DDP耐藥細胞中，敲除lncRNA HOTAIR后，能夠逆轉細胞的化療耐藥[13]。lncRNA HOTAIR可作為多種腫瘤患者預后預測的分子標記物[14]，然而lncRNA HOTAIR的表達及與AML患者預后的關系尚不清楚。

本研究采用qRT-PCR法檢測健康志愿者和初診AML患者外周血中lncRNA HOTAIR表達，結果顯示，lncRNA HOTAIR在初診AML患者外周血中高表達，此結果與lncRNA HOTAIR在膀胱癌[15]、乳腺癌[16]等實體腫瘤組織中的表達一致。提示lncRNA HOTAIR高表達可能參與并且促進了AML的發生。本研究接受標準DA方案化療的86例患者中，有56例患者完全緩解，化療后完全緩解AML患者外周血lncRNA HOTAIR表達較化療前降低，提示lncRNA HOTAIR表達與AML的化療療效相關；化療過程中檢測lncRNA HOTAIR表達變化可監控AML患者的病情。

AML患者常伴有嚴重的并發癥，如外周血WBC異常增高，致使血液黏度增加，小血管內易形成微血栓，損傷肺、腦等重要器官，進而導致呼吸窘迫綜合征、腦出血等危及生命的并發癥[17]；AML患者常伴有PLT減少癥，對于PLT計數<50×109/L的患者，需要預防性或治療性輸注PLT，而PLT輸注無效引起的嚴重出血是導致AML患者高病死率的重要原因之一[18]；此外，低Hb與AML患者的總生存時間密切相關，且可作為AML患者長期無復發生存的預測指標[19]。本研究發現，lncRNA HOTAIR高表達預示患者具有較高的WBC水平，較低的PLT、Hb水平。提示lncRNA HOTAIR高表達的AML患者常合并多種并發癥。

lncRNA HOTAIR高表達的AML患者，接受化療后的完全緩解率更低，且總生存時間更短，提示lncRNA HOTAIR高表達具有作為AML患者不良預后靶分子的潛能。

綜上所述，本研究證實lncRNA HOTAIR在初發AML患者外周血中高表達，且經化療獲得完全緩解后，lncRNA HOTAIR表達水平有所下降；lncRNA HOTAIR高表達的AML患者完全緩解率低、總生存時間短，預后更差。lncRNA HOTAIR可作為AML治療和預后預測的潛在靶點。

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