荔枝核總黃酮對TGF-β1誘導人肝星狀細胞凋亡的影響及機制

曹杰，林麗馨，覃桂金，肖緒華，霍群，趙永忠

(1桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林541000；2廣西壯族自治區南溪山醫院；3桂林醫學院)

肝纖維化(HF)的主要特征為細胞外基質(ECM)在肝內過度沉積，是一種常見的慢性組織損傷的細胞創傷愈合反應[1]。活化的肝星狀細胞(HSC)是ECM的主要來源，在HF的發展過程中扮演重要角色。研究表明，HF處于動態變化過程中是可逆的[2]，故使活化及增殖的HSC被抑制并誘導其凋亡有望成為抗HF的有效方法[1]。Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號通路在HF過程中起重要作用，是肝細胞凋亡途徑之一。目前常規西藥對HF的治療效果不理想[3]。抗纖維化的相關中藥受到了廣泛重視。荔枝盛產于兩廣地區，荔枝核中具有藥理活性的主要物質之一為荔枝核總黃酮(TFL)。研究證明，TFL對膽汁淤積性大鼠有較好的抗纖維化效果，且可阻滯HSC增殖、誘導其凋亡，達到抗HF的效果[4～6]。2015年12月～2016年5月，本研究以人肝星狀細胞(HSC-LX2)為研究對象，探討TFL對活化的HSC-LX2凋亡的影響，進一步明確其干預HF進展的相關分子機制，為TFL的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 HSC-LX2(中美合資博慧斯生物醫藥科技有限公司)。TFL(南京澤朗醫藥科技有限公司，純度 80%)。DMEM 高糖培養液(GIBCO公司)；胎牛血清FBS(GEMINI公司)；轉化生長因子β1(TGF-β1,美國Peprotech公司)；TLR4單克隆抗體(Abcam公司)；NF-κB p65單克隆抗體(ProMab公司)；Anti白細胞介素1受體Ⅰ(IL-1RⅠ)多克隆抗體(Abcam公司)；β-Actin單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG 抗體(北京中杉金橋公司)；山羊抗兔IgG 抗體(北京中杉金橋公司)；流式凋亡試劑盒(美國BD公司)；流式周期試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；Hoechst33258(碧云天公司)。流式細胞儀(美國BD 公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，全自動凝膠成像分析系統(上海培清JS-780)，全自動化學發光圖像分析系統(上海Tanon 5200)，倒置相差顯微鏡(德國蔡司)。

1.2 試劑配制 配制TGF-β1：用pH=3的檸檬酸鈉試劑將TGF-β1粉末充分溶解，配制成168 ng/μL的母液，-20 ℃保存；取母液，配制成20 μg/L的儲存液，4 ℃保存。配制TFL：用DMSO試劑將純度80%的TFL充分溶解，將溶解的TFL溶于DMEM(含10%FBS及靑鏈霉素)中，配制成1 g/L的母液。將母液配制成實驗所需的藥物濃度，同時使各組中(除正常組外)TGF-β1的終濃度為5 μg/L[7]。

1.3 細胞培養 將細胞接種于含10% FBS的DMEM(含青霉素+鏈霉素)培養液中，于37 ℃、5% CO2及合適濕度的培養箱中培養。當細胞處于對數生長期時，用含EDTA的胰蛋白酶消化傳代。將細胞隨機分為正常組、TGF-β1組及150、300、600 mg/L TFL組。正常組常規培養；其他四組接種于含10% FBS的DMEM+5 μg/L TGF-β1、10 cm培養皿中，培養24 h后，150、300、600 mg/L TFL組分別加入150、300、600 mg/L TFL培養48 h[5]。

1.4 細胞形態學變化觀察 采用Hoechst33258染色法。收集各組細胞，吸盡培養液，PBS洗2次，固定10 min，PBS洗2次；加Hoechst 33258染色液，避光染色5 min；PBS洗2次，封片。用倒置相差顯微鏡觀察并拍照，實驗重復3次。

1.5 細胞周期檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞，用含EDTA的胰酶進行消化，收集細胞于EP管中，PBS沖洗2 次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS 1 mL 懸浮細胞，95%乙醇(4 mL)冰浴，4 ℃冰箱過夜。1 000 r/min 離心5 min，PBS 沖洗1次，每個樣本加入400 μL PI染色液(1倍)，重懸細胞，37 ℃ 避光孵育30 min，上機檢測各周期細胞比例。實驗重復3次。

1.6 細胞凋亡檢測 采用FITC Annexin V/PI雙染色法。收集各組細胞，用不含EDTA的胰酶進行消化，收集細胞于EP管中，PBS沖洗2次，4 ℃離心機離心，2 000 r /min，10 min；棄上清液，加入Buffer緩沖液100 μL，混勻；避光加入FITC Annexin V 5 μL+PI 5 μL，室溫避光孵育30 min，上機前加Buffer緩沖液200 μL，混勻，200～300目過濾，流式細胞儀檢測細胞早期(細胞膜外翻)、晚期(細胞膜外翻，細胞釋放其他物質)凋亡情況，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7 細胞內TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，用胰蛋白酶進行消化，收集細胞于EP管，PBS清洗3遍，1 000 r/min離心，離心3次，每次5 min，加入足量蛋白裂解液，冰上充分裂解，4 ℃，15 000 r/min離心后，上清液即為所提蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉膜，BSA封閉，孵育一抗，孵育二抗，發光顯色，實驗重復3次。蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組細胞形態學變化比較 TGF-β1組細胞增殖活躍，呈聚集狀，胞體增大，胞突伸展、延長，數量明顯增加。正常組、TGF-β1組細胞核形態完整；150、300、600 mg/L TFL組可見細胞核固縮、裂解、凋亡小體形成等細胞凋亡形態學變化，并隨TFL濃度的升高，細胞數量減少，凋亡細胞增多。

2.2 TFL對HSC-LX2周期的影響 隨TFL濃度升高，TFL組G0/G1期細胞增多(P<0.05)，S期細胞減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同周期細胞分布比較

注：與TGF-β1組比較，*P<0.05；與150 mg/L TFL組比較，△P<0.05；與300 mg/L TFL組比較，▲P<0.05。

2.3 TFL對HSC-LX2凋亡的影響 隨TFL濃度的升高，TFL對HSC-LX2細胞凋亡促進作用增強，更傾向于促進細胞晚期凋亡。見表2。

表2 各組細胞凋亡率比較

注：與TGF-β1組比較，*P<0.05；與150 mg/L TFL組比較，△P<0.05；與300 mg/L TFL組比較，▲P<0.05。

2.4 TFL對HSC-LX2內TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表達的影響 150、300、600 mg/L TFL組TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表達量低于TGF-β1組(P均<0.05)，且隨TFL濃度升高，HSC-LX2內TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白表達量逐漸降低(P均<0.05)。見表3。

表3 各組TLR4、NF-κB、IL-1RⅠ蛋白相對表達量比較

注：與TGF-β1組比較，*P<0.05；與150 mg/L TFL組比較，△P<0.05；與300 mg/L TFL組比較，▲P<0.05。

3 討論

HF是各種因素引起的病理性慢性炎癥修復反應。當肝細胞損傷時，促發炎癥反應，分泌大量細胞因子和化學介質，共同作用于HSC，使HSC發生活化，合成大量ECM，沉積于肝內，導致HF的發生發展[8]。伴隨細胞因子與相應受體結合的HSC活化與增殖，是HF的關鍵環節。

細胞周期可分為四個階段：G0/G1期即DNA合成前期，為DNA合成做準備；S期即DNA合成期；G2期即DNA合成后期；M期又稱D期即有絲分裂期。HSC-LX2細經TGF-β1活化后，可見細胞胞體增大，胞突伸展、延長，且數量明顯增加，呈增殖狀態。流式細胞術檢測顯示，TFL作用于增殖的HSC-LX2，使HSC-LX2阻滯于G0/G1期，不能為DNA合成準備原料，DNA無法合成，致使細胞增殖分裂無法進行，細胞周期被阻滯。細胞凋亡是主動進行的，是由基因調控的程序性死亡，在生物體的生長發育、各種疾病的發生發展過程中都發揮重要作用。結果顯示，TFL作用于增殖的HSC-LX2后，可見細胞核固縮、裂解、凋亡小體形成等，呈現凋亡形態學變化，且隨著藥物組濃度的增大，細胞數量減少，凋亡比例增加。同時TFL對HSC-LX2凋亡具有促進作用，且更傾向于促進細胞晚期凋亡，達到抗HF的效果。然而，其分子機制仍不明確，仍需進一步明確其可能存在的關系。

TLR是先天免疫識別受體，在人體內具有重要作用，其與炎癥反應及纖維化形成過程中的信號傳遞關系緊密。TLR4在多種細胞上表達，其中包括HSC；不管是靜止的HSC還是活化的HSC，均表達TLR4。TLR4的完整信號轉導通路存在于活化的HSC中。TLR4激活后通過信號轉導使下游的核心因子NF-κB激活，活化的NF-κB進人細胞核進行轉錄調控，誘導細胞凋亡[9]。NF-κB具有多向性調節作用，參與調控多種因子的表達，在免疫調控、炎癥、應激反應及細胞凋亡中發揮重要作用[10]。活化的NF-κB調控炎性因子的表達，大量炎性介質被釋放，引起肝臟損害[11]。本研究結果顯示，TGF-β1激活后的HSC-LX2，經TFL干預后，細胞內TLR4、NF-κB蛋白表達降低。韋錚武等[12]研究表明，TFL可通過降低TLR4、NF-κB在活化的HSC-T6中的表達，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，減輕HF。因此，推測TFL誘導活化的HSC-LX2凋亡的分子機制可能與降低TLR4、NF-κB的表達相關，從而達到抗纖維化的效果。

IL-1為重要的免疫和炎性反應調節因子，有研究顯示，IL-1在炎性致病機制中起決定作用；而IL-1存在于大多數體內細胞，當發生炎癥反應時，IL-1可迅速發生作用[13]。IL-1可促進HSC活化、增生及抑制ECM的降解[14]。當肝細胞損傷時，IL-1可以加重肝臟損傷[15]。研究發現，IL-1是NF-κB信號通路最重要的炎癥細胞因子，通過與跨膜受體IL-1受體(IL-1R)結合后激活下游信號通路，在HF發生發展中起重要作用[16]。當致炎因子作用于機體時，IL-1與相應受體結合，傳導生物學信號，發揮生物學效應。IL-1受體家族包括IL-1RⅠ和IL-1RⅡ。目前認為IL-1RⅠ是IL-1的主要受體。TLR細胞內區域的其中約200個氨基酸與IL-1RⅠ及其他數種植物疾病抵抗蛋白具有高度的同源性，稱TIR[17]。TLR和IL-1R構成的系統TLR-IL-1R是炎性反應時機體產生免疫應答和炎癥反應的關鍵信號系統。有研究表明，大黃和丹參通過弱化TLR-IL-1R信號通路的作用，控制急性胰腺炎炎癥的放大過程[18]。本研究結果表明，各濃度TFL組TLR4、IL-1RⅠ蛋白表達降低，且呈濃度依賴性，隨TFL濃度升高，TLR4、IL-1RⅠ蛋白表達逐漸減低。因此，推測TLR-IL-1R炎癥通路可能參與了HF的過程，但其具體分子機制尚待進一步研究。因此，通過抑制TLR-IL-1R炎癥通路，有望成為抗HF的一條新途徑。

總之，導致HF發生發展的信號傳導通路眾多，且通路之間相互交叉，細胞及動物實驗目前尚不能明確其具體機制，仍需進一步研究證實。

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