SLE合并SONFH患者血清差異表達蛋白篩查

賴崇榮，曾平，劉雄，陳金龍，范思奇，秦剛，周怡，廖小波，何凱毅，劉明偉，周艷瓊，黃碧秋

(1廣西中醫藥大學，南寧530001；2廣西中醫藥大學第一附屬醫院；3廣西醫科大學)

目前，激素性股骨頭壞死(SONFH)確切的發病機制仍未徹底闡明，其早期診斷與治療仍然缺乏特異的生物學標志物，是骨科領域的常見疑難疾病[1]。蛋白質組學技術為SONFH疾病機制的闡明、早期診斷與治療提供了理論依據及解決方法。目前，SONFH的蛋白質組學研究尚處在起步階段，使用類固醇皮質激素(GC)后發生SONFH的蛋白質組學研究鮮有報道。本研究以血清差異蛋白質組學作為切入點，以SLE合并SONFH患者作為研究對象，采用同位素相對標記與絕對定量技術(TMT)聯合二維液相色譜-串聯質譜(2D-LC-MS/MS)，篩查用于闡明SONFH發病機制的血清特異性蛋白標志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年4月～2016年6月廣西中醫藥大學第一附屬醫院臨床收治的SLE合并SONFH患者10例(SONFH組)，均為女性，年齡(43.50±7.32)歲，國際骨循環學會分期Ⅱ期2例、Ⅲ期3例、Ⅳ期5例。納入標準：符合SLE的診斷標準[2]；符合SONFH的診斷標準[3]；滿足GC的服用條件及服用總量(3個月內)≥2 000 mg強的松、連續服用時間≥1個半月[4]。另選健康志愿者5例作為對照組，均為女性，年齡(42.00±6.16)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。

1.2 血清樣品采集 清晨抽取兩組空腹肘靜脈血10 mL，置于枸櫞酸鈉采血管，于4 ℃冰箱放置1～2 h，3 000 g 離心 10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 血清差異表達蛋白篩查 蛋白提取及酶解：按照 ProteoExtracrTM試劑盒操作說明書去除血清中的高豐度蛋白，洗脫液加入5倍體積丙酮，-20 ℃沉淀3 h，離心后晾干蛋白沉淀塊，加入適量Resolution Buffer復溶血清蛋白。用Bradford法測定蛋白濃度。取蛋白樣品100 μg，用8 mol/L Urea buffer調整體積。加入終濃度10 mmol/L二硫蘇糖醇于37 ℃孵育45 min，再加入終濃度25 mmol/L碘乙酰胺室溫避光孵育55 min，用三乙胺-碳酸緩沖溶液(TEAB)稀釋Urea后進行酶解。根據質量比1∶50加入trypsine，37 ℃酶解過夜，再次按質量比1∶100加入trypsine，37 ℃二次酶解4 h。采用TMT聯合2D-LC-MS/MS進行檢測。肽段標記：Strata X C18(Waters公司提供)對酶解后的蛋白樣品進行脫鹽處理，按照TMT Kit Protocol對肽段進行標記。將除鹽后的肽段溶于100 mmol/L TEAB，乙腈41 μL溶解TMT試劑(0.8 mg)，并與肽段100 μg合并后室溫反應1 h，加入羥胺終止標記反應，合并各組樣品后真空干燥。肽段組分分離：分別將兩組標記肽段使用Waters HPLC e2695/2998色譜儀(Waters公司)，用高pH C18 RP色譜柱(Thermo公司)進行餾分分離。待收集的肽段流出組分后，真空抽干，合并成8個組分，分別將每個組分溶于nanoLC A 液20 μL，進樣2 μL，經上樣柱上樣后通過分析柱梯度洗脫，用Orbitrap Elite組合式質譜儀進行鑒定。用Proteome Discoverer 1.3(Thermo Scientific)軟件將Orbitrap Elite對肽段鑒定的原始圖譜文件(.raw文件)轉化為.mgf文件，用MASCOT2.3.0服務器于數據庫中檢索。通過MASCOT服務器上形成的查庫文件，根據錯誤發現率<0.01的標準對數據進行篩選。以兩組血清蛋白差異倍數>1.20為蛋白表達上調，<0.83為蛋白表達下調。

1.4 生物信息學分析 通過Uniprot數據庫中的注釋信息鑒定篩選出差異表達蛋白質，選擇GO的生物過程、細胞成分和分子功能注釋對蛋白進行分類和富集分析；利用KEGG數據庫進行信號通路分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。用雙樣本等方差假設對兩組蛋白相對表達量進行雙尾t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異蛋白篩查結果 與對照組比較，SONFH組共鑒定出差異表達血清蛋白16種。其中免疫球蛋白重鏈1(IGHV1OR15-1)、銅藍蛋白(CP)、α1-酸性糖蛋白(ORM1)、補體C9(C9)、IGHG1蛋白、C反應蛋白(CRP)、結合珠蛋白(HP)表達上調。SERPINA4蛋白、凝溶膠蛋白(GSN)、凝血因子Ⅻ(F12)、色素上皮細胞衍生因子(SERPINF1)、備解素(CFP)、巰基氧化酶1(QSOX1)、凝血因子ⅩⅢ(F13A1)、KRTDAP蛋白、胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)表達下調。

2.2 差異表達蛋白GO功能注釋聚類分析結果 生物過程方面發現差異蛋白主要參與了單一生物過程、細胞過程、生物調節、應激反應、生物過程的調控、代謝過程、生物過程的負調控、多細胞生物過程、生物過程的正調控、細胞定位、多生物過程、發育過程、免疫系統過程、信號傳導、生長過程、細胞成分組織、細胞定位、節律過程、生物黏附。分子功能方面發現差異蛋白主要涉及結合、催化活性、分子功能的調節、抗氧化活性。細胞構成方面差異蛋白主要定位于胞外區、細胞器、細胞膜、大分子復合物組分、膜蛋白、細胞外基質、細胞連接等部位。

2.3 差異蛋白KEGG通路注釋聚類分析結果 見表1。

表1 差異蛋白參與的信號通路

3 討論

迄今為止，SONFH的發病機制尚不明確。國內外研究者從分子、基因水平對SONFH發病機制進行深入研究，提出了多種學說，如脂質代謝紊亂、血液凝溶、氧化應激反應、微血管損傷、細胞凋亡學說等[5]；但只針對某一病因，大多涉及1個或多個細胞因子、酶、基因等，而疾病的發生發展可能是多種因素的結果，目前尚無一種學說能夠全面闡明其發病機制。本研究應用TMT聯合2D-LC-MS/MS技術檢測，篩選出SONFH組與對照組有差異的蛋白16個，通過KEGG通路注釋進一步提取到與8個差異蛋白相關的12條KEGG信號/代謝通路。差異蛋白主要集中在補體與凝血級聯反應、系統性紅斑狼瘡、肌動蛋白細胞骨架調節、p53信號通路、卟啉和葉綠素代謝、FcγR-介導吞噬等，說明血液凝溶系統、免疫系統、脂代謝及基因多態性與SONFH的發病密切相關。

血液高凝狀態被認為是SONFH的關鍵性發病因素，F12、F13A1在機體血液凝溶系統中發揮重要作用。F12是血管生成的生理性調節因子，抑制凝固過程的發展，激活凝血酶活化纖溶抑制物，抑制纖維蛋白溶解，可在血管損傷的修復中發揮重要作用。Raghu等[6]指出F13A1表達異常，引發機體高凝狀態，增加了SONFH的發病風險。本研究發現，SONFH組與對照組比較，F12、F13A1表達下調，并富集至補體和凝血級聯反應信號通路。CP作為血清中一種具有氧化酶活性的α2-糖蛋白，可促進細胞生長、誘導血管生成或新血管形成的生理作用。王偉等[7]研究表明，在類風濕患者中，CP表達的高低與類風濕因子呈正相關，可見CP與類風濕密切相關；但其在SONFH發病機制所起的作用尚未見報道。本研究結果顯示，SONFH組與對照組相比，CP蛋白表達上調，并富集至卟啉和葉綠素代謝信號通路。提示SONFH患者股骨頭的壞死塌陷及隨后出現的修復反應，血管的生成可能處于一種活躍狀態。股骨頭壞死與修復不是完全分開而是同時交織進行，因此推測F12、F13A1、CP可能在股骨頭壞死與修復過程中發揮誘導新血管形成的作用。本研究認為F12、F13A1、CP可能是SONFH的特異性蛋白標志物。

免疫系統蛋白表達與SONFH發病機制緊密相關，補體系統在組織重塑過程中起著調節細胞凋亡和壞死的重要作用。C9具有防止免疫復合物沉著、活化補體的作用。Cuadrado等[8]認為，在SLE等自身免疫性疾病中經常發現的抗磷脂抗體能引起血栓，使患者處于骨壞死高危狀態，激素的應用則增加了自身免疫性疾病骨壞死的發病率。本研究也觀察到免疫反應相關蛋白在SONFH血清中的表達上調，并富集至補體和凝血級聯反應、系統性紅斑狼瘡、朊病毒疾病、阿米巴病四條信號通路，提示免疫反應可能涉及該病的發病過程，這些蛋白有可能涉及補體的激活。HP作為一種血漿糖蛋白，具有能與紅細胞外血紅蛋白結合構成非共價復合物的生理功能，當機體介導炎癥時其血漿中的含量升高[9]。本研究發現，SONFH組與對照組比較，C9、HP表達上調，提示SONFH患者可能因為免疫系統紊亂，加重了壞死組織損傷并阻滯骨組織的修復。基于此，推測C9、HP可能是SONFH的特異性蛋白標志物。GSN是一種肌動蛋白，介導細胞因子的釋放、炎性細胞的凋亡以及炎性介質的清除等，對炎癥反應發展與轉歸有極其重要影響。Hu等[10]對類風濕關節炎與SLE患者的GSN進行測定，結果提示GSN可能對SLE的診斷和活動度判斷有重要價值。Wu等[11]通過血清蛋白質組學技術發現，ONFH患者中GSN水平較對照組下降，提出GSN參與了體內的各種有害反應，但GSN在ONFH中的生物學作用尚不清楚。本研究發現，SONFH組與對照組比較，GSN下調，并富集至肌動蛋白細胞骨架調節、FcγR-介導吞噬、病毒致癌這3條信號通路上，反映其在SONFH中發生的各種有害反應，包括細胞凋亡、組織壞死或骨壞死以及血管退化。推測GSN極其可能是SONFH的特異性蛋白標志物。

脂質代謝紊亂是SONFH的主要病理表現。脂肪因子在脂質代謝過程中起著重要作用，PEDF是脂肪來源的分泌性糖蛋白，通過甘油三酯脂肪酶來調節脂質代謝[12]。孫少松等[13]發現，PEDF可明顯提高成骨細胞的遷移能力，抑制成脂主要調節因子PPARγ-2的表達，上調成骨標志因子Runx2的表達，有效促進成骨細胞向成骨分化及礦化，從而改善成骨細胞的功能。本研究中，SONFH組與對照組相比，PEDF表達下調，顯示SONFH患者存在骨代謝水平的改變，其成骨細胞數量明顯減少。因此本研究認為PEDF可能是SONFH的特異性蛋白標志物，提示SONFH患者存在脂質代謝異常及氧化應激水平的改變。SONFH患者長時間服用GC，可能導致機體血管脂肪栓塞、血脂升高、骨細胞脂質代謝功能障礙，從而進一步降低了股骨頭骨髓基質干細胞增殖及分化能力，甚至直接誘導骨髓干細胞分化為脂肪細胞而發生骨壞死，進而誘發ONFH。

基因遺傳多態性與SONFH發病機制密切相關。IGFBPs家族具有調節骨代謝及其相關疾病的作用不斷得到實驗研究與臨床觀察的證實，但其基因多態性與SONFH的關系一直未見報道。研究表明，IGFBP3與股骨頭壞死的發生發展密切相關。Hong等[14]在2010年應用基因芯片分型技術發現，IGFBP3基因rs2453839突變位點與ANFH發生發展呈現高風險，首次闡述IGFBP3基因多態性與ONFH發病關聯。季志英等[15]發現，早熟患兒血清IGF-1水平升高而IGFBP3水平降低，表明早熟患者成骨細胞的刺激因子、血清中軟骨細胞分裂增殖水平升高。本研究發現SONFH組IGFBP3表達下調，并富集至p53信號通路、在癌癥轉錄失調，可能證實IGFBP3基因多態性與SONFH存在高度相關性，為進一步進行該基因相關的表觀遺傳學研究奠定了基礎，也為臨床SONFH的分子水平防治，提出了監控的主要分子靶標之一。

綜上所述，本研究應用差異蛋白質組學的研究方法，應用TMT聯合2D-LC-MS/MS技術及蛋白質組學檢測技術，篩查出F12、F13A1、CP、HP、補體C9、GSN、PEDF、IGFBP3等與SONFH相關的差異表達蛋白質，極可能是SONFH潛在的特異性生物學標志物。以上蛋白涉及與SONFH發病機制密切相關的血液凝溶系統、免疫系統、脂類代謝及基因多態性，但其在SONFH發生、發展中的具體作用機制尚未完全清楚，需進一步研究評價其可靠性。

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