Bmi-1基因沉默對鼻咽癌細胞CNE2生物學行為的影響

王巧，羅清，李亞軍，3，鄒彥

(1貴州省人民醫院，貴陽550002；2遵義醫學院附屬腫瘤醫院；3遵義醫學院第三附屬醫院)

鼻咽癌(NPC)是我國常見的惡性腫瘤，好發于鼻咽部咽隱窩和頂前壁，在我國南部及東南亞具有較高的發病率[1,2]。放療和化療是NPC主要的治療手段，然而，仍有約20%的患者在治療后出現局部復發和遠處轉移，導致Ⅲ～Ⅳ期NPC患者的5年生存率僅為10%～40%[3]。因此，尋求更高效、安全的治療方法是臨床關注的重點。Bmi-1是多梳基因家族(PcG)的重要成員，在乳腺癌、結直腸癌、非小細胞肺癌等多種實體瘤組織中高表達[4～6]，參與腫瘤發生、發展的多個生物學行為，如細胞增殖、侵襲及凋亡、腫瘤發生及干細胞的自我更新和分化[7]。研究發現，Bmi-1在癌組織中的表達水平與腫瘤形成、疾病進展、侵襲與轉移及疾病不良預后密切相關[8,9]。2014年10月～2016年3月，本研究用shRNA慢病毒特異性沉默NPC的CNE2細胞內Bmi-1基因表達，探討其對細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響，為NPC的分子靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人胚腎上皮細胞(293T)購買于昆明細胞庫，人NPC細胞株(CNE2)由廣州中山醫科大學培養，慢病毒載體PLVx-shRNA2、PLP1、PLP2、PLP/VSVG購于長沙贏潤生物技術公司，LipofectamineTM2000購于上海英濰捷基貿易有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于TaKaRa，兔抗人Bmi-1多克隆抗體購于英國Abcam公司，二抗-山羊抗兔、內參β-actin購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 PLVx-shRNA2-Bmi-1重組載體的構建 查找Bmi-1(NM=005180)在GeneBank中的mRNA核苷酸鏈，根據shRNA設計原則，設計3條不同的shRNA干擾片段，分別設計酶切位點：EcoRI、BamHI，引物合成由上海生工生物公司完成。shRNA1的F序列：ATCCGGAATGGTCCACTTCCATTGATCAAGAGT-

CAATGGAAGTGGACCATTCCTTTTTTG；shRNA2的F序列：GATCCGGGTCATCAGCAACTTCTTCTTCAAG-

AGAGAAGAAGTTGCTGATGGACCCTTT；shRNA3的F序列：GATCCGCCAATGGCTCTAATGAAGATTTCA-AGAGAATTTCATTAGAGCCATTGGCTTTTTTG。

1.3 慢病毒包裝、濃縮及滴定 將PLVx-shRNA2、PLP1、PLP2、PLP/VSVG按照TIANGEN(DP106)進行質粒提取，輕柔加入LipofectamineTM2000與各質粒DNA混合液，共轉染處于對數生長期293T細胞，常規培養過夜，上述培養條件孵育48 h收集細胞上清液，于4 ℃、3 000 g、離心20 min，加入Lenti-XTM concentrator獲得病毒濃縮液。采用孔稀釋法測定病毒滴度，將病毒原液按10倍梯度稀釋。取10個無菌的EP管，每個管中加入無血清培養基90 μL，取待測的病毒原液10 μL 加入第1個管，混勻，取 10 μL加入第2個管，繼續相同操作至最后一管。各管分別取10 μL 加入各孔293T細胞，熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況，計算病毒滴度，病毒滴度(TU/mL)=表達熒光細胞數/病毒原液量。

1.4 CNE2細胞感染及最佳沉默效率篩選 采用含10%胎牛血清的培養基培養CNE2細胞，常規換液傳代。取出病毒液，濃度進行梯度稀釋，使其感染復數(MOI)分別為100、10、1。加入Polybrene儲液1 μL，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育30 min。感染48 h后觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況，當GFP大于80%用于后續實驗，此時MOI為最佳。選取MOI=100用于后續實驗感染CNE2細胞。將CNE2細胞隨機分為5組，對照組不進行感染，shRNA1、2、3組分別感染表達shRNA1、2、3的慢病毒，空載體組感染空載的慢病毒。感染48 h后用TRIzol法提取細胞總RNA，根據試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR反應，讀取Ct值，應用2-ΔΔCt法計算Bmi-1基因的相對表達量。提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，根據說明書用TBST液稀釋一抗(Bmi-1 1∶1 000，β-actin 1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，次日TBST液洗膜3次，每次5 min；同樣方法稀釋二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h后進行ECL顯色，凝膠圖像分析系統成像，Image J軟件測出目的條帶的灰度值，計算Bmi-1蛋白相對表達量。根據RT-PCR及Western blotting法檢測結果，篩選沉默Bmi-1的最佳干擾序列。

1.5 Bmi-1基因沉默后CNE2細胞增殖能力檢測 采用平板克隆形成實驗。感染48 h后收集各組細胞，接種于6孔板，400個/孔，37 ℃、5% CO2環境中培養，根據細胞生長情況換液，培養2周或肉眼可見克隆斑時，4%甲醛固定細胞15 min；PBS清洗3次，結晶紫染色20 min，PBS洗凈后晾干，拍照，計數細胞。

1.6 Bmi-1基因沉默后CNE2細胞凋亡和周期檢測 采用流式細胞術。感染48 h后收集各組細胞，常規培養，胰酶消化，用培養基重懸細胞。加入1×BindingBuffer 400 L輕柔重懸細胞沉淀。移取AV-FITC(暗室操作)5 μL，混勻后室溫暗室孵育15 min。移取PI 10 μL，混勻后暗室中放在冰上5 min，30 min內上機檢測細胞凋亡比例。細胞周期樣品制備(同細胞凋亡)，用冷卻的70%乙醇1 000 μL混勻細胞，沉淀，置于4 ℃冰箱2 h以上，1 000 g離心5 min，換PBS重復上述步驟。加入PI 500 μL，輕柔吹打細胞，置37 ℃暗室，檢測各期細胞比例。

2 結果

2.1 PLVx-shRNA2-Bmi-1重組質粒測序鑒定結果 將構建的PLVx-shRNA2-Bmi-1進行序列分析，結果顯示：插入的序列與設計的3條shRNA序列堿基排列一致，說明目的片段均已正確插入，PLVx-shRNA2-Bmi-1慢病毒表達載體構建成功。

2.2 Bmi-1-shRNA的沉默效率 對照組、空載體組及Bmi-1-shRNA1、2、3組中Bmi-1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、0.98±0.01、0.45±0.03、0.17±0.01、0.14±0.01。與其他兩組比較，Bmi-1-shRNA1、2、3組Bmi-1 mRNA相對表達量低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3組最低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3的抑制效率=(1-0.14)/1×100%=86.00%。對照組、空載體組及Bmi-1-shRNA1、2、3組中Bmi-1蛋白相對表達量分別為0.89±0.02、0.86±0.04、0.67±0.01、0.54±0.05、0.36±0.04，與其他兩組比較，Bmi-1-shRNA1、2、3組Bmi-1蛋白相對表達量低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3組最低(P均<0.05)。

2.3 沉默Bmi-1基因對CNE2細胞增殖的影響 空載體組、Bmi-1-shRNA3組中細胞克隆形成數目，分別為(271.67±18.77)、(203.3±20.21)個/視野，與空載體組比較，Bmi-1-shRNA3組增殖能力弱(P均<0.05)。

2.4 沉默Bmi-1基因對CNE2細胞凋亡的影響 空載體組、Bmi-1-shRNA3組中細胞凋亡率分別為10.00%±0.40%、 12.97%±0.72%，與空載體組比較，Bmi-1-shRNA3組細胞凋亡率高(P均<0.05)。

2.5 沉默Bmi-1基因對CNE2細胞周期的影響 空載體組、Bmi-1-shRNA3組中G1期細胞比例分別為45.57%±10.34%、67.98%±7.85%，S期細胞比例分別為38.62%±6.12%、24.74%±5.58%，與空載體組比較，Bmi-1-shRNA3組G1期細胞比例高，S期細胞比例低(P均<0.05)。

3 討論

放療和化療是NPC主要的治療手段，然而，由于NPC解剖部位的特殊性及早期臨床癥狀不明顯，導致大部分患者在就診時已是局部晚期或遠處轉移，致使NPC 5年生存率低，臨床預后差[10]。Bmi-1基因最早在鼠淋巴瘤細胞中發現[11]，是PcG家庭的重要成員。PcG家族是由多種與細胞周期和增殖相關的轉錄抑制因子組成，是一類重要的與發育相關的基因，在干細胞的維持、胚胎發育和腫瘤發生中有著不可忽視的作用。研究發現，Bmi-1基因在癌組織中的表達高低與腫瘤形成、疾病進展、侵襲與轉移、疾病不良預后密切相關[8,9]。

目前，有關Bmi-1基因在NPC中的研究國內外報道甚少。為了研究沉默Bmi-1基因對NPC細胞生物學行為的影響，為NPC的分子靶向治療提供實驗依據，本研究采用RNAi感染技術，構建慢病毒表達載體特異性沉默Bmi-1基因。該技術可特異性剔除或關閉特定基因的表達，抑制靶點基因。與腺病毒系統、逆轉錄表達系統相比，慢病毒載體系統具有持久、穩定地表達外源基因的優點。因此，本研究選取了慢病毒“四質?！毕到y進行病毒包裝，即慢病毒表達載體(PLVx-shRNA2)、包裝載體(PLP1、PLP2、PLP/VSVG)、脂質體2000共轉染293T細胞。鏡下觀察到293T持續表達熒光，與Xu等[12]的研究結果一致，說明PLVx-shRNA2-Bmi-1重組載體已成功感染293T細胞。

Liu等[13]研究發現，RNAi干擾技術可抑制Bmi-1基因在乳腺癌MCF-7細胞的表達，其抑制率可達80%。本研究為獲得沉默Bmi-1基因最佳的干擾片段，設計并合成了3條針對Bmi-1基因的shRNA1、2、3片段，檢測結果顯示，shRNA1、2、3對Bmi-1均有不同程度的抑制，其中shRNA3的抑制效果最佳，抑制效率約為86%。由于慢病毒載體感染對宿主細胞有一定程度的細胞毒性，在感染前需摸索慢病毒的最佳MOI值，本研究結果顯示，當MOI=100時，CNE2細胞的感染效率為80%以上。

研究指出，作為INK4a/ARF基因的轉錄抑制位點，Bmi-1主要通過編碼p16INK4a和p14ARF(動物為p19ARF)兩個腫瘤抑制蛋白進行調控。P16INK4a能夠抑制細胞周期蛋白依賴性激酶的活性，通過CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F使細胞停滯于G0/G1期，無法進入S期。P14ARF則通過MDM2-P53通路來調控細胞周期，進而達到調控細胞周期、細胞凋亡以及維持腫瘤干細胞自我更新能力的目的[14，15]。降低Bmi-1基因在宮頸癌細胞中的表達會導致G1期細胞比例增加。本研究結果證實，沉默Bmi-1基因后，轉染組細胞凋亡率升高，G1期細胞比例增加。Zhou等[16]研究指出，沉默Bmi-1基因能抑制ECA109細胞的增殖能力。本研究結果顯示，沉默Bmi-1基因后，轉染組克隆形成數減少，增殖能力受到抑制。

綜上所述，本研究成功完成了慢病毒重組載體PLVx-shRNA2-Bmi-1的構建，篩選并獲得了沉默Bmi-1效果最佳的干擾片段(Bmi-1-shRNA3)，證實了Bmi-1基因表達降低可抑制CNE2細胞增殖，促進其凋亡，改變細胞周期。這可能為NPC的分子靶向治療提供實驗依據。

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