選擇性腸道去污染對創傷性截癱家兔小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px的影響

聶 海,劉 鵬，曹德乾，白春宏,周 際，劉齊東,安 洪

選擇性腸道去污染(selective decontamination of the digestive tract，SDD)是一種應用前景廣闊的預防感染、降低病死率的經濟、有效方法，已在ICU、胃腸、燒傷等科室感染治療中發揮著一定作用[1-4]，但目前尚未發現應用于脊髓損傷患者的報道。筆者已經通過動物實驗證實短期口服腸道抗生素選擇性抑制腸道潛在致病菌，防止細菌過度繁殖，可以有效控制脊髓損傷動物腸道細菌移位，但其具體機制尚不清楚。本研究通過探討SDD對急性創傷性截癱家兔小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性，明確氧化應激損傷在截癱家兔腸屏障功能損害中的作用及意義，為進一步研究截癱后腸道細菌移位和內毒素血癥的致傷機制提供實驗依據。

材料與方法

1 實驗動物與截癱家兔模型的建立

根據文獻報道建立動物模型[5]。根據研究目的和精度要求選擇40只體質量為2.0～2.5kg 6月齡清潔級健康家兔(第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供)，雌雄不限，隨機分為處理組和對照組，每組20只；另外增加正常對照組家兔10只。速眠新Ⅱ(解放軍軍需大學獸醫研究所研制)按0.2mL/kg體重肌肉注射麻醉后，取背部正中切口打開椎板，顯露并完全游離脊髓，從脊髓前方垂直于T6節段脊髓放入夾持力為98g的中號顯微血管夾夾持脊髓約1min、大腦皮層誘發電位證實脊髓完全橫斷，即未引導出大腦皮層誘發電位，僅出現大腦自發腦電活動。徹底止血后逐層關閉切口。術后予以肌注青霉素鈉50萬U，1次/d抗感染，肌注鹽酸哌替啶注射液1mg/kg，1次/d鎮痛處理。專人分籠飼養，飼養條件為室溫(20±2)℃、光線良好、環境安靜，給予普通飼料和清潔飲水，定期導尿預防膀胱尿潴留。

2 SDD處理方案[6-7]

截癱家兔模型建立后，隨機選擇20只癱瘓家兔灌飼(每8h灌飼1次，共4d)多粘菌素E(P)(重慶桑禾動物藥業有限公司提供，規格：250g/袋)、妥布霉素(T)(太極集團西南藥業股份有限公司，規格：80mg/支)和兩性霉素B(A)(華北制藥集團新藥研發有限公司，規格：25mg/支)進行消化道選擇性去污染(SDD)處理。SDD方案：在100mL生理鹽水中加入多粘菌素E 50mg，妥布霉素40mg，兩性霉素B 250mg制成混懸液，每次灌飼5mL。對照組灌飼等量生理鹽水。

3 標本的采集和保存

截癱家兔飼養4d后采集小腸組織標本保存或進行相關檢測。采取腹部正中切口，切開腹部皮膚、皮下及深筋膜組織，進入腹腔，切取距回盲部5cm左右適量小腸組織，用生理鹽水充分沖洗干凈腸內容物，稱取重量后，4℃生理鹽水制成10%的組織勻漿，4 000r/min 4℃冷凍離心10min，取上清分裝，-20℃冷凍保存待檢，留取部分上清液檢測組織總蛋白含量;同時切取距回盲部約10cm的小腸組織約1cm，生理鹽水沖洗干凈腸內容物，4%多聚甲醛固定。

4 檢測MDA含量和SOD、GSH-Px

將小腸組織制成10%勻漿，考馬斯亮藍法測定組織總蛋白含量，檢測步驟嚴格按照蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

改良硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)比色分析法檢測血漿和腸道組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，檢測步驟嚴格按照MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

黃嘌呤氧化酶法檢測血漿和腸道組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，檢測步驟嚴格按照SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

酶促反應谷胱甘肽消耗法檢測血漿和腸道組織谷胱甘肽過氧物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性，操作步驟嚴格按照GSH-Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

5 HE染色和圖像分析

將腸組織標本包埋、切片、脫蠟入水后進行HE染色。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。結果判定：細胞核呈藍色，細胞漿及其他組織呈粉紅色。在光鏡下觀察小腸病理組織學改變并進行圖像分析。按Chiu六級評分[8]評價小腸黏膜上皮損傷程度(0～5級)，并賦予相應的分值(0～5分)。每個動物觀察10個視野進行評分，其評分總和為小腸病理評分。

6 統計學分析

結 果

1 小腸組織MDA含量

正常組小腸組織MDA水平為(2.14±0.67)nmoL/mgprot；對照組為(8.19±1.22)nmoL/mgprot；處理組為(3.58±0.98)nmoL/mgprot，多組均數間比較具有統計學意義(F=150.907,P<0.001)。處理組與對照組均數間比較小腸組織MDA含量明顯降低(P<0.001)，但仍明顯高于正常組小腸組織MDA水平(P<0.001)。見圖1。

圖1 小腸組織MDA含量比較

2 小腸組織SOD活力

正常組小腸組織SOD活性為67.4±5.9U/mgport、對照組為42.7±13.4U/mgport、處理組為57.2±9.4U/mgport，多組均數間比較具有統計學意義(F=19.737,P<0.001)。處理組與對照組比較小腸組織SOD活力明顯升高(P<0.001)，但仍較正常組小腸組織SOD活力低(P=0.0178)。見圖2。

圖2 小腸組織SOD活力比較

3 小腸組織GSH-Px活力

正常組小腸組織GSH-Px活性為115.6±9.8U/mgport、對照組為89.7±11.0U/mgport、處理組為111.6±12.0U/mgport，組間均數間比較具有統計學意義(F=26.228,P<0.001)。處理組與對照組比較小腸組織GSH-Px活力明顯升高(P<0.001)，而與正常組比較無統計意義(P=0.361)。見圖3。

圖3 小腸組織GSH-Px活力比較

4 小腸組織氧化應激反應與小腸病理評分之間的關系

從表1中可以看出，小腸HE染色Chiu病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關(P<0.01)，與SOD、GSH-Px呈顯著負相關(P<0.01)。見表1。

討 論

創傷性癱瘓患者有一半以上出現便秘、大便失禁或阻塞等腸道功能障礙[9]，發生發熱、全身炎癥反應綜合征( SIRS)、膿毒血癥等感染并發癥，成為癱瘓患者死亡的主要原因[10-12]，嚴重影響脊髓損傷患者身心健康。因此脊髓損傷后早期采取有效措施預防控制腸道細菌移位及內毒素血癥，對防治腸源性感染(enterogenic infection)、提高患者生存質量、降低病死率具有重要的臨床實用價值。SDD已在ICU、燒傷科等危重病患者感染治療中發揮著一定作用，但目前尚未發現應用于脊髓損傷患者的報道。筆者的前期研究已經證實SDD可以選擇性抑制和消滅截癱家兔腸道潛在致病菌，防止細菌過度繁殖，控制腸道細菌移位。

機體遭受脊髓損傷后產生全身應激對抗損傷，這種狀態持續將發生氧化應激反應[13]。這時機體免疫系統激活、炎癥介質釋放、毒素吸收及缺血-再灌注損傷等一系列病理生理變化均可產生大量氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸，導致脂質過氧化損傷[14]，進一步出現細胞膜結構紊亂，膜結合酶及受體脂質微環境發生改變，酶活性、受體功能下降以及DNA損傷，細胞超微結構特別是肌漿網和線粒體功能受損，進而引起生物體各種病理生理變化[15]。生物體在長期的進化過程中，形成了一套抗氧化系統來清除體內多余的氧自由基，抗氧化酶主要有SOD、GSH-Px等。SOD能將氧自由基歧化為H2O2，H2O2在GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)的催化下被清除。GSH-Px在細胞漿中直接參與清除H2O2，減少羥自由基的產生，促使體內的脂質過氧化物分解而減輕其毒性。機體創傷后氧化應激是氧化和抗氧化穩態失衡，表現為自由基的產生增多和(或)機體組織抗氧化能力下降，過度的氧化應激可導致組織損害，機體迅速出現衰竭甚至死亡。因此，氧化應激反應在創傷后機體的病理生理變化過程中起著重要作用。本研究建立截癱家兔模型并采用SDD處理截癱家兔，檢測不同時相點小腸組織MDA含量和SOD、GSH-Px活性，探討氧化應激在脊髓損傷后腸黏膜屏障障礙中的作用及意義，為進一步研究脊髓損傷后腸道功能障礙機制及患者救治提供實驗依據。

MDA是脂質過氧化反應最終代謝產物，在血清和組織中的含量反映了機體脂質過氧化的速度和強度；而SOD、GSH-Px是體內主要的自由基清除劑，具有保護生物體免受自由基的攻擊，催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，阻斷自由基的毒性作用，保護機體組織和細胞DNA免受氧化損傷。因此，同時檢測MDA含量和SOD、GSH-Px活性可了解自由基產生和抗氧化系統的功能狀態，是反映體內脂質過氧化水平的敏感指標。本實驗結果顯示，經SDD處理后的截癱家兔小腸組織內MDA含量較未處理的截癱家兔低，而SOD、GSH-Px活性升高，提示家兔截癱后體內脂質過氧化顯著增強，并維持在較高水平，機體抗脂質過氧化系統已不能代償氧化應激反應，但經SDD可改善脂質過氧化反應，減輕氧化應激損傷，從而保護腸黏膜。小腸HE染色Chiu氏病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關，與SOD、GSH-Px呈顯著負相關，表明小腸氧化應激反應與小腸病理學改變相關，氧化應激參與了脊髓損傷后腸黏膜的破壞過程。

氧化應激損傷可能與MDA升高或抗氧化酶降低有關。過量MDA與氨基酸反應和蛋白質交聯而損傷蛋白并降低細胞膜ATPase活性，其細胞毒性作用損傷生物膜，導致細胞損傷甚至死亡；機體SOD、GSH-Px等抗氧化酶急劇減少，不能有效清除脂質過氧化物產物，而氧自由基等可損傷內皮細胞，增加血管通透性，進一步導致間質細胞廣泛損傷，引起臟器功能失常，表明氧化-抗氧化系統失衡不僅是腹腔臟器損傷的結果，而且是促進傷情發展的重要原因之一。

截癱家兔小腸組織MDA含量增加和SOD、GSH-Px活性降低的可能原因：(1)創傷產生應激反應，機體應激狀態下交感-腎上腺髓質系統激活，腹腔內臟血管持續收縮導致胃腸道缺血低氧，氧自由基急劇增多，脂質過氧化反應增強導致組織細胞損傷，并產生大量MDA；(2)各種原因導致機體損傷后，為了抑制過氧化脂質啟動了抗脂質過氧化的保護系統。由于氧自由基生成增多，一方面攻擊SOD、GSH-Px并使其失活，另一方面氧自由基的不斷產生消耗了大量SOD、GSH-Px，從而導致血清和組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低。

綜上所述，截癱家兔小腸組織MDA含量明顯增高，而SOD、GSH-Px活性降低，經SDD處理后小腸組織內MDA含量降低，而SOD、GSH-Px活性升高，提示家兔截癱后體內脂質過氧化顯著增強，但SDD可改善脂質過氧化反應，減輕氧化應激損傷，從而保護腸黏膜。小腸HE染色Chiu氏病理評分與小腸組織MDA呈顯著正相關，與SOD、GSH-Px呈顯著負相關，表明小腸氧化應激反應與小腸病理學改變密切相關，氧化應激參與了脊髓損傷后腸黏膜的破壞過程。在臨床實踐中搶救、治療脊髓損傷患者時，適當應用SDD和抗氧化劑清除氧自由基[16-20]，減輕氧化應激損傷，對提高患者對創傷的抵抗力，維持機體免疫調控能力，促進病情好轉，具有重要的臨床應用價值。

[1] Hurley JC.Impact of selective digestive decontamination on respiratory tract candida among patients with suspected ventilator-associated pneumonia.A meta-analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2016,35(7):1121-1135.

[2] Abis GS,Oosterling SJ,Stockmann HB,et al.Perioperative selective decontamination of the digestive tract and standard antibiotic prophylaxis versus standard antibiotic prophylaxis alone in elective colorectal cancer patients[J].Danish Med J,2014,61(4):A4695.

[3] Roos D,Dijksman LM,Tijssen JG,et al.Systematic review of perioperative selective decontamination of the digestive tract in elective gastrointestinal surgery[J].Br J Surg,2013,100(12):1579-1588.

[4] Silvestri L,de la Cal MA,Taylor N,et al.Selective decontamination of the digestive tract in burn patients: an evidence-based maneuver that reduces mortality[J].J Burn Care Res(Am),2010,31(2):372-374.

[5] Bai C,An H,Wang S,et al.Treatment and prevention of bacterial translocation and endotoxemia with stimulation of the sacral nerve root in a rabbit model of spinal cord injury[J].Spine,2011,36(5):363-371.

[6] Roos D,Dijksman LM,Sondermeijer BM,et al.Perioperative selective decontamination of the digestive tract (sdd) in elective colorectal surgery[J].J Gastrointest Surg,2009,13(10):1839-1844.

[7] Speekenbrink AB,Alcock SR,Forrester J,et al.The effect of selective decontamination of the digestive tract with the addition of systemic cefotaxime on the aerobic faecal flora of mice[J].Epidemiol Infect,1987,98(3):385-395.

[8] Chiu CJ,McArdle AH,Brown R,et al. Intestinal mucosal lesion in low-flow states.I.A morphological,hemodynamic,and metabolic reappraisal[J].Arch Surg,1970,101(4):478-483.

[9] Kattail D,Furlan JC,Fehlings MG.Epidemiology and clinical outcomes of acute spine trauma and spinal cord injury:Experience from a specialized spine trauma center in canada in comparison with a large natinal registry[J].J Trauma.2009,67(5):936-943.

[10] Lalwani S,Punia P,Mathur P,et al.Hospital acquired infections: preventable cause of mortality in spinal cord injury patients[J].J Lab Physicians,2014,6(1):36-39.

[11] Eves FJ,Rivera N.Prevention of urinary tract infections in persons with spinal cord injury in home health care[J].Home Healthc Nurse,2010,28(4):230-241.

[12] Liu J,An H,Jiang D,et al.Study of bacterial translocation from gut after paraplegia caused by spinal cord injury in rats[J].Spine,2004,29(2):164-169.

[13] Luo J,Shi R.Diffusive oxidative stress following acute spinal cord injury in guinea pigs and its inhibition by polyethylene glycol[J].Neurosci Lett,2004,359(3):167-170.

[14] Elsayed NM,Gorbunov NV.Pulmonary biochemical and histological alterations after repeated low-level blast overpressure exposures[J].Toxicol Sci,2007,95(1):289-296.

[15] Parihar A,Parihar MS,Milner S,et al.Oxidative stress and anti-oxidative mobilization in burn injury[J].Burns,2008,34(1):6-17.

[16] Hamann K,Shi R.Acrolein scavenging: a potential novel mechanism of attenuating oxidative stress following spinal cord injury[J].J Neurochem,2009,111(6):1348-1356.

[17] Takenaga M,Ohta Y,Tokura Y,et al.Lecithinized superoxide dismutase(pc-sod) improved spinal cord injury-induced motor dysfunction through suppression of oxidative stress and enhancement of neurotrophic factor production[J].J Control Release,2006,110(2):283-289.

[18] Kayali H,Ozdag MF,Kahraman S,et al.The antioxidant effect of beta-glucan on oxidative stress status in experimental spinal cord injury in rats[J].Neurosurg Rev,2005,28(4):298-302.

[19] Torres S,Salgado-Ceballos H,Torres JL,et al.Early metabolic reactivation versus antioxidant therapy after a traumatic spinal cord injury in adult rats[J].Neuropathology,2010,30(1):36-43.

[20] Mishra V.Oxidative stress and role of antioxidant supplementation in critical illness[J].Clin Lab,2007,53(3-4):199-209.