醒腦靜對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用及機制

李衛(wèi)萍， 杜菊梅， 張 磊， 申艷方， 陳向榮， 王 茹

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一類好發(fā)于70歲以上人群的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多表現(xiàn)為認知障礙、精神及行為異常、生活工作能力退化等。在疾病進展過程中，β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 在人體內(nèi)大多以聚合物、單體及不溶性纖維存在，大腦中產(chǎn)生或沉積過量的Aβ會引發(fā)錯誤的折疊，導致神經(jīng)元損傷，與退行性病變相關，同時過量的Aβ可激活一系列的病理事件(血腦屏障破壞、微循環(huán)變化)及炎癥反應，最終導致神經(jīng)元細胞變性和死亡，是阿爾茨海默病發(fā)生的病理基礎[1]。目前阿爾茨海默病的治療主要是控制伴發(fā)的神經(jīng)、精神癥狀，包括使用一些抗焦慮、抗抑郁、抗精神病藥等以及使用益智類及改善認知功能的藥物。醒腦靜作為腦代謝賦活藥物通過擴張腦血管、增加腦皮質(zhì)細胞對氧及其他生物素的利用發(fā)揮作用[2]，醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎上改制形成的水溶性注射液，包含了麝香、冰片、梔子、郁金等中藥成分[3]。麝香開竅，止痛，有破血化淤功效；冰片氣清香，味辛涼，主散郁火，能透骨熱，常與麝香配伍；梔子清熱，瀉火，涼血；郁金行氣解郁，清心涼血，有鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用[3]。醒腦靜的有效成分極易通過血腦屏障直接作用于神經(jīng)細胞和神經(jīng)元發(fā)揮作用，常用于中風昏迷、腦梗死、顱腦外傷及阿爾茨海默病的治療[4～6]，對腦組織起到保護作用。本實驗通過檢測不同濃度醒腦靜對Aβ 25～35誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡模型的影響，初步探討醒腦靜治療阿爾茨海默病的機制。

1 材料與方法

1.1 主要細胞系及細胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)系購自中國科學院上海細胞庫，細胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 μg /ml)，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)于無菌孵箱，每2 d更換1次培養(yǎng)液，當細胞融合度達到80%～90%時，0.25%Trypsin-0.03%EDTA 消化傳代細胞。

1.2 Aβ的孵育 Amyloid β-Protein Fragment 25～35，系購自sigma公司，使用1.8 ml重蒸水將1 mg Aβ 25～35溶解成濃度為500 μmol/L的母液，于37 ℃條件下孵育7 d以形成聚集形式的Aβ 25～35，根據(jù)要求制備工作液用于實驗，母液-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AD細胞模型構建及醒腦靜實驗分組 采用Aβ 25～35誘導SH-SY5Y細胞制備阿爾茨海默病凋亡細胞模型，選取對數(shù)生長狀態(tài)的SH-SY5Y細胞，實驗前1 d更換1%血清DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)處理，使細胞達到同步化狀態(tài)，去除血清、雙抗等其他因素對細胞的影響，24 h后給予濃度為：25 μmol/L的Aβ 25～35刺激，作用于細胞24 h，使SH-SY5Y細胞達到細胞凋亡模型狀態(tài)，根據(jù)細胞形態(tài)及生長狀態(tài)判斷造模是否成功。

醒腦靜實驗分組：對照組：SH-SY5Y細胞用DMEM完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；造模組：SH-SY5Y細胞加入終濃度為25 μmol/L的 Aβ 25～35培養(yǎng)24 h；Aβ 25～35+醒腦靜組：不同濃度的醒腦靜(2 ml/L、4 ml/L、8 ml/L)分別預處理SH-SY5Y細胞3 h，隨后加入25 μmol/L的Aβ 25～35共同培養(yǎng)24 h。

1.4 細胞形態(tài)的觀察 選取處于對數(shù)生長狀態(tài)的SH-SY5Y細胞，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以(1～1.5)×106個/ml 的濃度接種于6孔板，每孔接種4 ml混勻的細胞懸液，分對照組與實驗組，實驗前1 d給予無血清處理以排除血清及雙抗對實驗結果影響，實驗組加入Aβ 25～35使Aβ終濃度分別維持在0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L，對照組加等量培養(yǎng)液，24 h后觀察Aβ 25～35對SH-SY5Y細胞的影響，用顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，記錄并拍照。

1.5 MTT細胞增殖實驗 選取處于對數(shù)生長狀態(tài)的SH-SY5Y細胞，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以(1～1.5)×104個/ml 的濃度接種于96孔板，每孔接種200 μl混勻的細胞懸液，分別設置5個副孔，去掉最大及最小的吸光度值所在副孔，其他三孔求平均值則為該組的吸光度值；設置1組為空白對照組，空白對照組只加培養(yǎng)液及MTT液，不接種細胞。接種96孔板5塊，分別在每天同一個固定時間向待檢測96孔板每孔加入20 μl，5 mg/ml MTT溶液，其余未檢測96孔板在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。待檢測96孔板加入MTT液37 ℃，5% CO2孵育4 h后移去培養(yǎng)液，排槍每孔加入150 μl DMSO，在490 nm波長下酶聯(lián)免疫儀檢測各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 不同處理組細胞經(jīng)胰酶消化后制備單細胞懸液，PBS漂洗3遍，收集細胞沉淀，加入固定液固定，調(diào)整細胞濃度為不少于1×106個/ml，使用Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒檢測，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.7 Western blot法檢測bcl-2、bax水平 取處理48 h后不同組細胞，PBS沖洗后置于冰上裂解(含有cocktail的1*ripa裂解液)20 min，經(jīng)槍頭吹打后置于超聲裂解3 min，12000 r/min離心15 min，收集總蛋白，BCA法蛋白定量。取樣品50 μg進行SDS-聚丙乙烯酰胺凝電泳，待轉(zhuǎn)至纖維素膜后，10%脫脂牛奶封閉1 h，一抗(Bcl-2抗體、Bax抗體)4 ℃過夜孵育，次日室溫復溫30 min后，TBST洗膜3～5次，每次3 min，室溫孵育二抗1 h，置于TBST中，洗膜3～5次，增強化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光。

2 結 果

2.1 Aβ25～35誘導SH-SY5Y細胞凋亡模型 分別給予SH-SY5Y細胞不同濃度Aβ 25～35[0(對照組)、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L Aβ 25～35]，使其作用于細胞24 h，誘導細胞凋亡模型，MTT法檢測各組細胞存活情況(見圖1A)，電子顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化，記錄并拍照(見圖1B)。結果可見：與對照組相比，隨著Aβ 25～35造模劑濃度的增加，細胞存活率逐漸下降，在Aβ 25～35濃度為50 μmol/L時細胞存活率約為50%；顯微鏡觀察對照組細胞形態(tài)呈梭形，核形規(guī)則，密度均勻，細胞數(shù)量較多，隨著Aβ 25～35造模劑濃度的增加，Aβ造模組細胞由梭形變?yōu)椴灰?guī)則方形，突起變短，同時細胞大小固縮且分布不均，細胞數(shù)目減少(見圖1B)。綜合Aβ 25～35對細胞的毒性及殺傷作用，結合查閱文獻，選定25 μmol/L為Aβ 25～35誘導SH-SY5Y細胞凋亡模型的最適宜濃度。經(jīng)25 μmol/L Aβ 25～35誘導SH-SY5Y細胞24 h后凋亡模型造模成功。

2.2 醒腦靜對Aβ25～35誘導的SH-SY5Y細胞增殖的影響 MTT法檢測不同濃度的醒腦靜(2 ml/L、4 ml/L、8 ml/L)對Aβ 25～35誘導的SH-SY5Y細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)：加入醒腦靜組細胞(Aβ 25～35+2 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+4 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+8 ml/L醒腦靜)的增殖情況較單純造模組細胞增殖明顯增強，并且隨著醒腦靜濃度的增加，其增殖水平逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(見圖2)。說明醒腦靜可以通過促進Aβ誘導的SH-SY5Y細胞增殖拮抗Aβ 25～35誘導細胞凋亡，具有保護作用。

2.3 醒腦靜對Aβ 25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響 與對照組相比，Aβ 25～35造模組細胞凋亡率明顯高于對照組，充分說明Aβ 25～35誘導細胞凋亡模型構建成功，同時Aβ 25～35+2 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+4 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+8 ml/L醒腦靜組SH-SY5Y細胞的凋亡率較造模組降低，并且隨著醒腦靜濃度的增加，細胞存活率增加，總體凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學意義(見圖3)。說明醒腦靜可以抑制Aβ 25～35誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡，其對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞凋亡具有保護作用。

2.4 醒腦靜對Aβ25～35誘導的SH-SY5Y細胞Bcl-2、Bax表達的影響 與對照組相比，Aβ 25～35造模組細胞Bcl-2含量明顯減少，Aβ 25～35誘導細胞凋亡模型成功，抗凋亡蛋白Bcl-2含量隨著醒腦靜濃度的增加表達含量增加；與對照組相比Aβ 25～35造模組細胞Bax含量明顯升高，同時促凋亡蛋白Bax含量隨著醒腦靜濃度的增加表達含量下降，說明醒腦靜可以通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達和抑制Bax的表達，導致兩者比值失調(diào)，抑制Aβ 25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡過程，其對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞凋亡具有保護作用(見圖4)。

圖1 Aβ25～35誘導SH-SY5Y細胞凋亡模型

圖2 醒腦靜對Aβ 25～35誘導的SH-SY5Y細胞增殖的影響

3 討 論

阿爾茨海默病的特征性病理變化是細胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑(SP)和細胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化導致神經(jīng)原纖維纏結(NFT)形成[7]。現(xiàn)階段可通過Aβ 1～42、Aβ 1～40或Aβ 25～35淀粉樣蛋白刺激模擬AD老年斑形成構建阿爾茨海默病研究模型[8，9]，Nestheide等[10]研究表明Aβ淀粉樣蛋白可通過誘導凋亡相關基因Bcl-2、Bax及P53等導致神經(jīng)元缺失。

研究證實，多種中草藥具有清除氧自由基和抑制炎癥反應作用[11]，醒腦靜作為這一類醒腦開竅藥物的代表，可用于治療各類腦炎、腦病[12，13]。有研究證實醒腦靜注射液有十分明確的抑制腦缺血-再灌注損傷和防治腦神經(jīng)細胞凋亡作用[14]。張煥等[15]在對認知功能障礙大鼠的研究中證實醒腦靜注射液可增加海馬區(qū)nNOS表達、降低血清β-淀粉樣蛋白含量，從而保護海馬組織形態(tài)的完整性，改善老年認知功能障礙大鼠的空間學習記憶能力。

圖3 醒腦靜對Aβ 25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

圖4 醒腦靜對Aβ 25～35誘導的SH-SY5Y細胞Bcl-2、Bax表達的影響

細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路主要包括膜受體通路和線粒體通路這兩條，醒腦靜可對神經(jīng)細胞凋亡中的多個環(huán)節(jié)進行干預以減少神經(jīng)細胞的凋亡，包括抑制凋亡誘導的啟動、拮抗凋亡執(zhí)行蛋白酶活化和調(diào)節(jié)凋亡相關基因表達等[16，17]。細胞凋亡在促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的調(diào)控下發(fā)生，兩種蛋白相互拮抗維持動態(tài)平衡對于細胞凋亡發(fā)揮重要作用[18]。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，由Bcl-2/Bax組成的異源二聚體形成動態(tài)平衡調(diào)節(jié)體系，其比率決定是否發(fā)生細胞凋亡，比值越低越容易發(fā)生細胞凋亡，Bcl-2及Bax這一動態(tài)平衡調(diào)節(jié)作為P53調(diào)控的重要靶點，組成了P53介導的線粒體依賴凋亡途徑[18，19]。本實驗通過建立Aβ 25～35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡模型，給予不同濃度醒腦靜處理造模組細胞，探討不同濃度醒腦靜對Aβ 25～35誘導的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡途徑的保護作用及其機制。實驗結果顯示Aβ 25～35作用于SH-SY5Y細胞后引起了細胞凋亡，醒腦靜通過降低促凋亡蛋白的表達，提高抗凋亡蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡，進一步通過western blot的方法推測其通過作用于Bcl-2、Bax這類凋亡相關蛋白發(fā)揮保護作用。

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