IL-2激活的NK細胞對膠質瘤的殺傷作用

吳帥帥， 喬小放， 趙紅梅， 王曉科， 王海亮， 于 翔， 劉 軍

膠質瘤(glioma)是指上皮組織來源的腫瘤，是最常見的原發性顱內腫瘤[1]，成人中的發病率為8/10萬。依據WHO分級系統，其分為WHOⅠ～Ⅳ級，Ⅰ級和Ⅱ級屬于低級別膠質瘤，Ⅲ級和Ⅳ級屬于高級別膠質瘤，其中膠質母細胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)是惡性程度最高的高級別膠質瘤。臨床表明，手術治療是腦膠質瘤的首選方法，但膠質母細胞瘤浸潤生長，與腦組織界限不清等特點，造成外科手術難以全部切除。加上惡性腦膠質瘤對放化療的治療不是很敏感，因此，為了延長患者生存期及改善遠期生活質量，膠質母細胞瘤的治療需要其他輔助方案。本實驗從生物治療方法出發，以動物實驗模型，研究白細胞介素2(IL-2)激活的自然殺傷細胞(NK細胞)對腦膠質具有一定程度的殺傷作用，希望為今后進一步研究提供有利依據。

1 材料與方法

1.1 NK細胞分離與純化 細胞提取：采集靜脈血50 ml →肝素抗凝→PBS稀釋抗凝外周血→加10 ml淋巴細胞分離液，離心15 min →取界面層細胞→再次離心10 min →PBS洗滌液混勻、離心棄上清→重復洗滌細胞操作1次→將細胞用PBS懸浮，待用。

NK細胞純化：(1)將以上所得細胞→加入分離緩沖液和抗CD56免疫磁珠比例混合→避光孵育15 min→加入1 ml 的PBS磷酸緩沖液離心，去上清→ PBS緩沖液懸浮細胞，備用。(2)PBS磷酸緩沖液細胞→加入ACS磁場分離→收集分選的陰性細胞→加入RPMI 1640培養基1 ml→分選的CD3-CD56+陽性細胞→獲得NK細胞→培養基懸浮細胞，待用。

NK細胞培養：100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640細胞培養基懸浮NK 細胞→接種于適量培養基的培養瓶→置37 ℃，5%二氧化碳的培養箱中培→以培養24 h后的NK細胞作為備用細胞。

1.2 GBM選擇培養與鑒定 腫瘤組織取自吉林大學第二醫院神經外科膠質瘤患者手術切除新鮮病理組織，術后病理報告診斷為膠質母細胞瘤，WHO分級Ⅳ級。免疫組化染色結果：Olig-2(+)、EMA(弱+)、GFAP(+)、S-100(+)、KI67(陽性率20%)、IDH-1(-)、CK(AE1/AE3)(-)。

GBM培養方法參考Parney 等[2]實驗設計。無菌條件取腫瘤組織塊約10 g→高壓滅菌分塊后0.25%胰蛋白酶消化→充分消化15 min成單個細胞→加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中止、濾過→2000 r/min，離心5 min，棄上清→取沉淀細胞，以每毫升3×105個細胞的密度接種于培養瓶→無菌37 ℃培養箱中培養12 h→取貼壁細胞→無菌PBS沖洗細胞2～3次，棄不合格細胞→再次加胰蛋白酶和培養基，成單細胞懸液→取懸液接種在新的培養瓶接種→無菌培養箱中培養、備用。

經培養的GBM經HE染色顯示：細胞呈分化差形態多樣的不規則形或星形細胞，細胞分化差、大小不一，細胞結構復雜，核異型性明顯，核分裂象多見。免疫細胞化學結果顯示Olig-2(+)、EMA(弱+)、GFAP(+)、S-100(+)、KI67(陽性率20%)與新鮮腫瘤組織大致相似。

1.3 小鼠模型 裸鼠分組：BALB/c裸鼠無菌環境下飼養→隨機分組，每組6只(A、B、C、D、E、F、G、H組)→A：無菌裸鼠對照組；B：體內移植GBM組織組；C：體內注射IL-2組；D：體內注射NK細胞組；E：同時移植GBM組織和NK細胞組；F：同時移植IL-2和NK細胞組；G：GBM組織、NK細胞和IL-2移植組。

建立動物模型：(1)取培養的GBM組織→胰蛋白酶消化、離心→無血清DMEM/F12培養基→GBM細胞的懸液→微量注射器將0.1 ml GBM細胞懸液→皮下注射于BALB/c裸鼠背部皮下。(2)取純化的NK細胞懸液→無血清培養基中計數→配制細胞的懸液→微量注射器0.2 ml NK細胞懸液→尾靜脈注射于BALB/c裸鼠體內。(3)取0.2 ml IL-2→微量注射器經尾靜脈注射裸鼠體內。經尾靜脈注射IL-2、NK細胞和皮下注射GBM同一天進行，且先注射GBM組織懸液。

腫瘤組織生長監測：自腫瘤組織、NK細胞與IL-2移植之日起，每天密切觀察裸鼠生長情況及是否體內成瘤生長。記錄裸鼠體內開始產生瘤體時間，每日測量腫瘤組織的最大長徑(mm)與最大寬度(mm)，分別記為α、β，腫瘤體積計算公式：V=αβ2/2(mm3)[3]。腫瘤出現后21 d處死帶瘤裸鼠，解剖裸鼠取完整腫瘤組織，測量腫瘤重量[4]。

腫瘤組織病理：取裸鼠腫瘤組織HE染色，觀察病理組織細胞形態，行免疫組化。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0分析實驗數據。各組數據行小樣本t檢驗，P<0.05表示差異性具有統計學意義。

2 結 果

2.1 實驗裸鼠生長情況及成瘤情況 實驗結果：各組實驗裸鼠無非正常死亡。裸鼠成瘤情況：B組(體內移植GBM組)；E組(同時移植GBM組織和NK細胞組)；G組(GBM組織、NK細胞和IL-2移植組)小鼠體內有均瘤體產生(見表1)。

2.2 B組、E組與G組裸鼠首次出現瘤體時間情況 實驗結果表明：B組、 E組、G組、小鼠體內有均瘤體產生，腫瘤出現時間為(8.91±1.42)d、(14.22±2.12)d、(17.56±1.89)d。B組與 E組相比，小鼠體內注射NK細胞后成瘤時間延長，二組比較有明顯差異。E組與G組相比，小鼠體內注射IL-2后體內成瘤時間會延長，具有明顯差異(見表2、表3)。

2.3 各成瘤裸鼠組體內腫瘤生長情況 實驗結果表明：NK細胞能有效抑制膠質瘤在裸鼠體內生長。圖表顯示移植GBM組織后出現膠質瘤的裸鼠體內腫瘤細胞生長受NK細胞的抑制作用，且IL-2可以增強NK細胞抑制作用(見圖1)，橫軸表示瘤體出現時間(d)，縱軸表示瘤體體積(×100 mm3)。

2.4 B組、E組與G組裸鼠體內腫瘤重量分析 實驗表明：腫瘤出現21 d后，處死裸鼠取完整腫瘤組織，并分別稱重、計算瘤體重量。結果顯示：E組比B組小鼠體內的腫瘤重量小，二組比較有明顯差異。G組比E組小鼠體內腫瘤重量要小，兩組P<0.05，具有明顯差異(見表4、表5)。

表1 各組小鼠生長及成瘤情況

表2 B組與E組小鼠出現瘤體時間

表3 E組與G組裸鼠出現瘤體時間

表4 B組與E組小鼠體內腫瘤重量

表5 E組與G組小鼠體內腫瘤重量

2.5 移植CBM組織裸鼠體內腫瘤組織病理分析 腫瘤組織病理：結合免疫組化染色結果及形態學特征考慮膠質母細胞瘤。免疫組化染色結果：Olig-2(+)、EMA(弱+)、GFAP(+)、S-100(+)、KI67(陽性率20%)、CK(AE1/AE3)(-)，考慮膠質母細胞瘤Ⅳ級(見圖2)。

圖1 B組、 E組、G組裸鼠腫瘤生長速度情況

圖2 腫瘤組織病理

3 討 論

GBM是星形細胞譜系惡性程度最高、侵襲性最強的彌漫性膠質瘤[5]，占惡性原發性腦和中樞神經系統腫瘤的45.2%，占所有膠質瘤的54%[6]。由于GBM惡性度高細胞生長快，侵襲腦組織嚴重，病程短等特點造成腦組織水腫、顱內壓增高癥狀明顯，基本所有患者前期都會出現頭痛、惡心嘔吐、視物模糊等癥狀；隨著病情加重漸漸表現出精神改變或意識障礙。如果腫瘤進一步浸潤性破壞腦組織，患者出現不同程度的肢體癱瘓、偏身感覺障礙、感覺或運動性失語等，甚至引起腦出血及腦疝，直接危及患者生命。GBM的診療方式一直是研究的熱點，雖然手術、放療還是化療，都取得了相對發展，但臨床治療效果還是無法滿足患者及家屬的預期，中位生存期為15 m[7]，相對生存期僅為2 y的占13.7%[6]，5 y生存率低于5%[8]。因此，探究新型生物免疫治療的可能是改善患者預后的關鍵性治療方法。

本次實驗通過體外培養人GBM細胞，將體外培養的GBM細胞進行動物體內移植，建立神經膠質瘤裸鼠移植模型并進行免疫細胞治療(提取健康人體內NK細胞同GBM細胞與IL-2共培養)，觀察NK細胞對神經膠質瘤動物模型的治療作用。研究顯示：人腦膠質母細胞瘤組織經過體外培養，然后經過移植小鼠體內生長出的腫瘤組織，經過病理分析基本一致，顯示了神經膠質瘤細胞的體外培養、傳代及神經膠質瘤分化的潛能；E、G組的裸鼠出現腫瘤時間比B組裸鼠的成瘤時間明顯變長；裸鼠體內腫瘤體積較B組裸鼠的明顯減小，說明NK細胞具有抵抗GBM的生長作用，同時也證明了IL-2能增強NK細胞對GBM細胞增殖及生長的抑制作用，在某種機制上減慢了腫瘤的生長。資料顯示，Stupp等[9]將IL-2激活的人NK細胞注射神經母細胞瘤的小鼠體內，實驗發現NK細胞可以進入瘤體組織中，而且發現了體內注射NK細胞的成瘤小鼠生長時間較對照組明顯延長。

NK細胞是非特異性免疫細胞，不需要抗原致敏，可以直接殺死腫瘤和病毒感染的靶細胞。NK細胞表面存在抑制性殺傷受體，靶細胞表面存在人白細胞抗原I類分子(HLA-I)類分子，當受體和此類分子結合時NK細胞的殺傷作用被抑制。當NK細胞結合的細胞表面缺少HAL類分子時才表現出NK細胞的作用。IL-2是免疫系統中的一類細胞生長因子，能調控免疫細胞活性，也參與抗體反應、造血和腫瘤監視，但沒有直接殺死腫瘤的作用。本實驗研究結果表明：IL-2激活的NK細胞對GBM抑制、殺傷效應，可能是NK細胞抑制膠質瘤細胞表面HLA-I類分子，從而誘發了其活性。有學者發現[9，10]，NK細胞存在協同效應的活化機制，如在小鼠的LAK細胞上的NKG2D是一種潛在的協同刺激受體，認為IL-2可通過促進NKG2D的表達活化NK細胞，從而增強了NK細胞對GBM的抑制及殺傷作用。因此，目前IL-2激活的NK細胞的機制還不清楚，關于IL-2激活的NK細胞對膠質瘤的殺傷作用還需進一步研究，希望NK細胞成為治療腦膠質瘤的關鍵生物免疫療法。

綜上所述，本次實驗初步證明了NK細胞對GBM細胞的抑制殺傷作用，希望通過本篇研究能為腦膠質瘤免疫療法的進一步研究和治療提供方向和幫助。

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